де n - кількість розчину, взятого на аналіз, мл; Р – розведення досліджуваного розчину.

водяній бані, перемішуючи скляною паличкою. Після охолодження розчину перевіряють рН потенціометрично і у разі необхідності доводять до значення 8,0 додаванням 1 н NaOH або 1 н HCl. Розчин можна зберігати у холодильнику не більше трьох діб .

2 %-й розчин гемоглобіну (субстрат). Для його приготування наважку 2 г

0,3 М розчин трихлороцтової кислоти. Для його приготування беруть наважку 50 г ТХО беруть на технічних терезах, переносять у колбу на1 л і доводять до мітки дистильованою водою, після чого фільтрують.

Визначення активності лужної протеази ( метод ФОЛП)

Метод розроблено на основі методу Ансона спеціально для визначення активності лужних протеаз.

За одиницю протеолітичної активності взято таку кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 г білка (казеїну) в строго визначених умовах– рН 10,5 і при температурі 40 оС, тривалість гідролізу 1 год.

Метод базується на визначенні тирозину, що утворюється в результаті гідролізу білка, з реактивом Фоліна, як і метод Ансона.

Техніка визначення

У дві пробірки заввишки20 см і діаметром2 см наливають по5 мл субстрату і витримують при температурі40 ºС в ультратермостаті протягом 10 хв для досягнення розчином зазначеної температури.

Потім у першу пробірку додають 2,5 мл дистильованої води (контроль), а

0,3 М розчину ТХО, щоб припинити ферментативну реакцію та осадити непрогідролізований казеїн. Суміш швидко перемішують і для більш повного осадження витримують 15 хв при температурі40 ºС в термостаті. Потім розчини фільтрують через паперові фільтри і у фільтраті визначають кількість прогідролізованого білка за тирозином.

56

Для цього по2 мл фільтрату наливають у широкі пробірки, повільно приливають у кожну по5 мл 0,5 М розчину вуглекислого натрію та по1 мл робочого розчину реактиву Фоліна, безперервно перемішуючи, витримують в ультратермостаті при температурі 40 ºС для розвитку забарвлення 30 хв, а потім фотометрують на ФЕК з довжиною хвилі 656–677 нм при використанні кювет 5

мл реакційної суміші, мг; 1000 – перерахунок на 1 г препарату.

Приклад розрахунку. На аналіз взято0,1 г ферментного препарату, розчинено в 100 мл дистильованої води. Із цього розчину зроблено розведення

– 5 мл до 100 мл, на протеоліз відібрано 2,5 мл. Після додавання ТХО об’єм реакційної суміші дорівнює12,5 мл. На визначення тирозину взято2 мл і отримано оптичну густину 0,193.

Тоді кількість ферментного препарату в 2 мл фільтрату буде дорівнювати:

Реактиви:

1. Розчин казеїну 1%-й. Для його приготування 2 г (порошку) і вносять у конічну колбу на 300 мл і приливають 140 мл карбонатно-гідрокарбонатного буфера рН 10,7. Колбу ставлять на магнітну мішалку і розчин перемішують протягом 30 хв. Потім, продовжуючи перемішування, колбу з субстратом вміщують у водяну баню з температурою70 ºС до повного розчинення, охолоджують до 40 ºС і при цій температурі доводять рН до10,5, додаючи 1 М розчин їдкого натрію.

Розчин казеїну кількісно переносять у мірну колбу на200 мл і додають карбонатно-гідрокарбонатний буфер до об’єму180 мл. Потім розчин казеїну охолоджують проточною водою до температури20 ºС і об’єм субстрату доводять до 200 мл тим самим буфером. Розчин зберігають у холодильнику не більше 3 діб.

2.0,2 М карбонатно-гідрокарбонатний буфер. Готують його змішуванням

умірній колбі на 200 мл розчин А – 45 мл, розчину Б – 5 мл, об’єм доводять до мітки дистильованою водою.

57