Количественное определение гистамина в крови по методу н.В. Климинкиной и с.И. Плитмана

Задание 1. Провести количественное определение гистамина в крови.

Принцип. Метод базируется на взаимодействии гистамина с диазотованным п-нитроанилином с образованием соединений оранжево-красного цвета.

Ход работы. Кровь, из которой предварительно осадили белки 10% раствором трихлоруксусной кислоты, для экстракции гистамина выдерживают в холодильнике на протяжении суток, фильтруют через бумажный фильтр. В одну пробирку отмеривают 2 мл фильтрата (опыт), в другую – 0,2 мл стандартного 200 мкмоль/л раствора гистамина и 1,8 мл воды (стандарт). В обе пробирки прибавляют по 3 мл воды и 1 мл 4% натрия нитрата. Пробирки тщательно встряхивают и кипятят на водяной бане 2 мин, затем охлаждают под струей водопроводной воды и прибавляют по 1 мл диазотованного п-нитроанилина (готовят перед применением из 0,1% раствора п-нитроанилина в 0,1 моль/л растворе хлоридной кислоты, прибавляя к 10 мл охлажденного раствора 1 мл 4% натрия нитрата). Тщательно перемешивают пробы и доводят их рН до 10,0 по универсальной бумаге, прибавляя 1,5 мл, а затем 0,5 мл 20% натрия карбоната. Содержимое пробирок перемешивают, охлаждают под струей водопроводной воды и прибавляют 2-3 капли 20% натрия гидроксида до появления окраски. Экстинкцию опытной и стандартной проб измеряют на ФЭК при длине волны 520-540 нм (зеленый светофильтр) в 5 мм кювете против контроля (10 мл воды, по 2 мл растворов натрия нитрата и диазотованного п-нитроанилина, 4 мл раствора натрия карбоната), перемешивают и прибавляют 0,6 мл раствора натрия гидроксида. Содержание гистамина (Х) в мкмоль/л рассчитывают по формуле:

Х = (Еоп.×200)/Ест., где Еоп. - экстинкция опытной пробы; Ест. - экстинкция стандартной пробы; 200 - концентрация стандартного раствора гистамина, мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение. Гистамин - биологически активное вещество, которое принимает участие в регуляции жизненных функций организма. Вызывает расширение сосудов на месте воспаления и тем самым ускоряет поступление лейкоцитов, приводящих к активации защитных сил организма; имеет непосредственное отношение к развитию аллергических и иммунных реакций, процессов сенсибилизации и десенсибилизации; выполняет роль медиатора боли. При обычных условиях гистамин находится преимущественно в неактивном (связанном) состоянии. В крови здорового человека его концентрация составляет 0,02-0,04 мкмоль/л. При некоторых патологических процессах (анафилактический шок, ожоги, сенная лихорадка и другие аллергические заболевания), а также при поступлении в организм химических веществ, в том числе лекарственных препаратов, количество свободного гистамина увеличивается. Гистамин вызывает спазм гладкой мускулатуры, расширение сосудов и снижение артериального давления; в связи с застоем крови в капиллярах и увеличением проницаемости их стенок имеет место отёк окружающих тканей и сгущение крови.

В клинико-биохимических лабораториях определение содержания некоторых биогенных аминов имеет диагностическое значение. При тяжелом нефросклерозе повышается содержание в плазме крови тирамина, в случае шока - серотонина, при аллергических заболеваниях - гистамина.