2.4 Разработка способа биотестирования степени загрязнения морской воды по ингибированию роста тест-культуры

В последние годы наряду с химико-аналитическим контролем качества воды все большее развитие приобретают методы биотестирования биологических организмов или систем [49]. Нередко результаты, полученные данными методами, дополняют друг друга [34]. Стоит отметить, что разработанные методики биотестирования водных экосистем в качестве индикаторов загрязнения в основном предусматривают использование многоклеточных организмов и растений, таких как рыбы, дафнии, морские рачки, морские и пресноводные водоросли и др. И лишь единичные стандартизованные методики в качестве индикаторных систем предусматривают использование микроорганизмов.

Так, в пресной воде для индикации загрязняющих веществ согласно (ИСО) 10712 [50] используют аэробную бактерию Pseudomonas putida. Сравнивая скорость роста бактерии в искусственной и естественной средах, судят об ингибирующем действии различных концентраций загрязняющих веществ.

(ИСО) 11348 [51] установил метод определения влияния различных загрязняющих веществ на свечение морских бактерий Vibrio fischeri. Методы имеют высокую чувствительность и позволяют определять наличие загрязняющих веществ в количествах, значительно более низких, чем ПДК данных соединений.

Стоит заметить, что при выборе метода определения загрязнений в пробе чувствительность имеет первостепенное значение. Граница чувствительности в нижнем пределе обычно должна быть 2..3 раза меньшей по сравнению с (ПДК) тестируемого загрязнения. Например, в отношении загрязнений, вызванных нефтепродуктами, (ГОСТ) 17.1.4.01-80 [52] регламентирует чувствительность используемого метода в нижнем пределе не более 0,05 мг/дм³. Данное обстоятельство должно в полной мере учитываться при выборе тест – микроорганизма применительно к данному виду загрязнений.

Руководствуясь вышеперечисленными стандартизированными требованиями, мы спланировали и провели серию экспериментов по выявлению штаммов микроорганизмов чувствительных к загрязнениям нефтепродуктами морской воды. При первоначальном выборе штаммов микроорганизмов руководствовались несколькими принципами, а именно: распространением, питательными потребностями (отсутствие в обычном рационе питания углеводородов нефти), сложностью приготовления питательных сред и препаратов, условиями культивирования, стабильностью культурально – физиологических свойств и простотой идентификации.

Наиболее полно данным требованиям, по нашему мнению, соответствовали факультативно анаэробные грамотрицательные палочки (типичный представитель - Escherichia coli), которые предположительно не способны утилизировать углеводороды нефти. В качестве образца сравнения в опытах необходимо было выбрать микроорганизм, который, по данным литературы, способен активно утилизировать нефтепродукты, например, грамотрицательная аэробная палочка Pseudomonas putida, распространенная в морской и пресной воде. Оба названных вида микроорганизмов часто встречаются в пробах, отобранных в зонах, загрязненных углеводородами.

В опытах использовали штаммы Е. coli M-17 и P. putida 2300, полученные из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Культуры указанных штаммов высевали на «голодный» агар, содержащий в качестве единственного источника углерода цитрат железа, и на минеральную среду Ворошиловой – Диановой с добавлением нефти, посевы инкубировали при температуре (27-29)С в течение 14 суток. Клетки P. putida 2300 обладали способностью расти на «голодном» агаре, а на минеральной среде с нефтью их рост заметно усиливался. Напротив, рост культуры E. coli М-17 на данных средах отсутствовал. На агаре Хоттингера оба микроорганизма активно размножались.

В последующем была поставлена серия опытов по определению ингибирующих рост E. coli М-17 концентраций нефтепродуктов. Микроорганизмы, выращенные на агаре Хоттингера, последовательно разводили физиологическим раствором. В качестве посевной дозы использовали концентрацию микроорганизмов 1000 м.к. в см³, определяемую по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. В жидкую среду Чапека, дополнительно содержащую 1% NaCl и нефть, вводили посевной материал. В качестве контроля использовали среду Чапека без нефти. Содержание нефти в среде было различно - от 5 до 50 мг/дм³. Культуры инкубировали при температуре 27-29 ^оС в течение 14 суток. Учет результатов проводили визуально по изменению мутности культуральной жидкости через каждые 24 ч роста. Было отмечено, что введение в состав среды 5 мг/дм³ нефти угнетает рост тест – культуры. Увеличение содержания углеводорода в среде угнетает рост E. coli, и при достижении концентрации 50 мг/дм³ рост полностью ингибируется. В то же время увеличение содержания нефти в среде в отношении P. putida являлось ростостимулирующим фактором.

Таким образом, в ходе проведения экспериментов было показано, что культура Escherichia coli М-17 в определенной степени чувствительна к содержанию в среде нефти, а значит, может быть потенциальным биологическим индикатором загрязнений, вызванных данным углеводородом.