1.4 Выбор направления исследований

В настоящее время актуальна проблема загрязнения вод в результате деятельности человека. Промышленные и сельскохозяйственные отходы, разливы нефтепродуктов из-за аварий и катастроф приводят к нарушению естественного биологического цикла, разрушают естественную среду обитания водных организмов. Результатом может быть практически полное вымирание водных организмов и изменение видового состава микроорганизмов. Одним из показателей неблагополучия морской воды по причине присутствия в ней нефтепродуктов является увеличение видового и количественного состава углеводородоокисляющих бактерий. Вышесказанное определило необходимость проведения микробиологического мониторинга акватории Азовского моря с целью индикации гетеротрофных сапрофитных микроорганизмов, в том числе нефтеокисляющих бактерий, являющихся маркерами загрязнения водных масс органическими веществами, нефтью и нефтепродуктами.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие за­дачи: изучить влияние условий транспортировки и хранения проб морской воды на жизнеспособность микроорганизмов, оценить биоразнообразие морских микроорганизмов в зависимости от антропогенного эвтрофицирования, изучить динамику накопления нефтеокисляющих микроорганизмов в различных по степени загрязненности участках акватории Азовского моря, попытаться разработать способ биотестирования степени загрязнения морской воды подобрав соответствующую тест-культуру.

Общее количество гетеротрофных аэробных микроорганизмов определяли чашечным методом с использованием агара Хоттингера. Для определения численности нефтеокисляющих бактерий использовали метод предельных разведений на среде Ворошиловой-Диановой с добавлением нефти в качестве единственного источника углерода, с последующей статистической обработкой по методу Мак-Креди. Метод включает приготовление разведений, посев в жидкую питательную среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исследуемой воды по таблице Мак-Креди. Чашечный метод определения количества микробных клеток обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных разведений, однако при посеве на мясопептонный агар (МПА) в чашки иногда происходит зарастание агара микрофлорой, обладающей ползучим ростом. В этом случае метод предельных разведении является более приемлемым. Посев разведений в среду Ворошиловой-Диановой производится при соблюдении условий стерильности в количестве 1,0 см³ каждого разведения в 3-5 пробирок, содержащих по 5,0 см³ минимальной среды с единственным источником углерода - нефтью. Результаты учитывают через 10-14 суток. После инкубации посевов при температуре (28-30) °С регистрируют наличие или отсутствие роста микроорганизмов визуально (помутнение среды, образование пленки, осадка). Наиболее вероятное количество микробных клеток в единице объема определяют с помощью таблицы, разработанной на основании методов вариационной статистики Мак-Креди.

2 Теоретические и экспериментальные исследования

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Штаммы микроорганизмов

Для биотестирования степени загрязнения нефтью морской воды использовали культуры Pseudomonas putida штамм 2300 и Escherichia coli штамм М-17, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича с типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. Для исследований использовали агаровые субкультуры указанных штаммов, которые хранились на полужидком агаре при температуре (0 – 4) С и пересевались раз в месяц. Подготовку, разведение и посев культур проводили в соответствии с указаниями ГИСК им. Л.А. Тарасевича [53].

2.1.2 Сырье, реактивы, препараты

В работе использовали сырье, реактивы, препараты, отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

2.1.3 Питательные среды и дополнительные растворы

Жидкие и плотные питательные среды (ПС) готовили из сухих коммерческих препаратов, в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями, их состав и характеристики удовлетворяли заданным требованиям.

2.1.4 Методы исследований

Отбор проб морской воды осуществляли в летне-осенний период. Пробы отбирали из поверхностного горизонта воды (10-20) см в районах предполагаемого бурения. Для отбора проб воды использовали стерильный батометр – бутылку. Пробы помещали в стерильные полимерные контейнеры, которые хранились и транспортировались при температуре (4-6) С.

В отбираемых пробах определяли общую концентрацию бактерий в 1 см³ воды путем высева на агар Хоттингера [53]. Количество нефтеокисляющих микроорганизмов определяли методом предельных разведений [54].

Для определения чувствительности микроорганизмов к загрязнениям нефти, последние высевали на «голодный» агар, содержащий в качестве единственного источника углерода цитрат железа, и на минеральную среду с добавлением нефти.

Для определения концентраций нефтепродуктов, ингибирующих рост микроорганизмов, культуры, выращенные на агаре Хоттингера, последовательно разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 1000 м.к. в см³ и вводили в жидкую среду Чапека, дополнительно содержащую 1% NaCl и нефть. В качестве контроля использовали среду Чапека без нефти. О наличии или отсутствие роста культуры судили визуально по изменению мутности среды или нефелометрическим методом.

2.1.5 Приборы и оборудование

Анализ проб воды, приготовление ПС и дополнительных растворов, микробиологический контроль и оценку результатов проводили на лабораторной базе биологического факультета ВятГУ.

2.1.6 Методы статистической обработки экспериментальных данных

Результаты экспериментальных исследований представлены в виде средних арифметических значений с определением доверительного интервала при уровне вероятности, равном 95%.

Статистическую обработку проводили методами вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента, а также методом корреляционного анализа. Обработку данных осуществляли с помощью компьютера, с использованием пакета программ вариационной статистики MS Excel 7.0.

2.2 Оценка биоразнообразия морских микроорганизмов как основа изучения зависимости их изменений от антропогенной нагрузки

2.2.1 Изучение влияния условий транспортировки и хранения проб морской воды на жизнеспособность микроорганизмов

Развитие микроорганизма в природе определяется его биоло­гическими особенностями, энергетическим обменом, кинетикой роста, способностями к адаптации, гра­ницами устойчивости к факторам внешней среды и т.д. Физико-химические факторы, характеризующие условия сре­ды обитания организмов, разнообразны, в частности к ним относится температура. При снижении температуры окружающей среды происходит замедление всех жизненных процессов у бактерий, направленное на сохранение жизнеспособности в экстремальных условиях. Данная закономерность положена в основу многих способов хранения микроорганизмов.

С учетом этого, для транспортировки из Краснодарского края в г. Киров и хранения проб морской воды был выбран температурный режим (4 - 6) С. Однако сложность своевременной доставки и анализа проб могли привести к получению недостоверных данных по показателю общего числа микробов. В этой связи исследования образцов выборочно проводились непосредственно после взятия проб морской воды и спустя 15 сут.

Пробы отбирали в стерильные пластиковые контейнеры объемом 3 см³, не допуская образования воздушного пространства под крышкой. В течение 1-2 ч проба доставлялась в лабораторию Темрюкского осетрового завода и хранилась в бытовом холодильнике при температуре (4-6) С в течение всего срока экспедиции (5-10) сут. Для определения общего микробного числа посев проб воды осуществляли на плотную питательную среду (ППС) на основе перевара Хоттингера в чашках Петри и инкубировали при температуре окружающего воздуха (26-30) С. Каждые 24 ч чашки просматривали на предмет роста микроорганизмов. По окончании экспедиции пробы помещали в сумку-холодильник с температурой хранения (6-10) С и в течение 24 ч доставляли в лабораторию микробиологии Вятского государственного университета. Пробы воды в течение 1-2 сут вновь высевали на агар Хоттингера в чашках Петри и инкубировали в термостате при температуре (27-29) С в течение 2 сут. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Общее микробное число в образцах морской воды, отобранных в районе предполагаемого бурения в августе 2005 г. (Х±I₉₅, n=4)

Место отбора	Точка отбора	Количество микробов в пробах воды, (тыс ж.м.к.см-3), высеянных на агар через
		2 ч	15 сут
Соловьевское гирло	1 2 4 6	143±25 37±8 5±1 0,06±0,01	161±29 48±11 4±1 0,07±0,02
Примечание. Точки отбора поверхностного горизонта воды отстояли от дна на 1-6 метров

Результаты исследований показали, что значения общего количества микробов в пробах воды, определенные сразу после взятия и спустя 15 суток, достоверно не различались. Поэтому выбранный температурный режим и время хранения были признаны пригодными для транспортировки и хранения проб морской воды и позволили обеспечить жизнеспособность микробов в образцах.