Тема 4. Лимитированный рост популяции. Хемостат. Экономический коэффициент и траты на поддержание

Теория: Данный раздел теории разработан в основном для популяций микроорганизмов, однако при соблюдении определенных условий и постоянстве внешних параметров он приложим также для описания динамики популяций многоклеточных организмов.

Экономический коэффициент. Траты на поддержание: Для описания и сравнения эффективности утилизации субстрата S при росте организмов используется так называемый экономический коэффициент Y, который определяется как

, (4.1)

где X и S соответственно концентрации биомассы и изучаемого субстрата. Данный параметр отражает прирост биомассы на единицу потребляемого субстрата и является важнейшей характеристикой ростовых процессов. По причинам, изложенным ниже, он также называется суммарным экономическим коэффициентом. Размерность экономического коэффициента зависит от применяемых размерностей концентрации биомассы и субстрата.

Если лимитирующий субстрат является источником углерода и энергии для процессов биосинтеза, то его значение, как правило, меньше единицы. Данный субстрат при потреблении затрачивается на два типа процессов. Первый тип процессов связан с собственно ростом и размножением. В этом случае эффективность потребления энергетического субстрата характеризуют так называемым ростовым экономическим коэффициентом Y_рост. Размерность данного параметра такая же, что и у определенного выше суммарного экономического коэффициента. Второй тип процессов связан с затратами на поддержание уже имеющейся биомассы – сохранением всех трансмембранных градиентов, восстановлением постоянно разрушающихся биополимеров, биомембран и т.д. В физиологии это называют основным обменом. Количественно траты энергетического субстрата на эти процессы характеризуют параметром m, называемым траты на поддержание. Размерность этого параметра – [время^-1]. Суммарный экономический коэффициент Y, ростовой экономический коэффициент Y_рост и траты на поддержание m согласно теории связаны следующим соотношением (Перт, 1978):

, (4.2)

где r - удельная скорость роста биомассы популяции. Соответственно, кинетика потребления субстрата на рост и поддержание биомассы описывается уравнениями:

. (4.3)

Динамика лимитированного роста популяции: Выделяют два типа процессов лимитированного роста популяций. В первом из них субстрат вносится в систему однократно, и далее он в процессе роста только потребляется. В микробиологии и биотехнологии такой процесс называют периодическим культивированием. Во втором процессе, который называется непрерывным культивированием, в ходе роста популяции субстрат постоянно добавляется в систему, при этом изымается избыток биомассы. Система, в которой скорости подачи субстрата и изъятия биомассы постоянны, называется хемостат (Перт, 1978; Smith, Waltman, 1995). Поскольку динамические уравнения, описывающие данные системы, несколько отличаются, рассмотрим их отдельно.

Периодическое культивирование: Динамика популяции в условиях периодического культивирования описывается следующей системой уравнений, известных как модель Моно (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

(4.4)

Здесь X – концентрация биомассы, S - концентрация лимитирующего субстрата, t – время, r_max - максимальная удельная скорость роста, K_S - константа насыщения, Y - экономический коэффициент. Система (4.4) имеет аналитическое решение вида (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

. (4.5)

Здесь S₀ и X₀ - начальные концентрации субстрата и биомассы соответственно. На практике часто применяется также первый интеграл системы (4.4):

(4.6)

Непрерывное культивирование. Хемостат: Для описания лимитированного роста популяции в хемостате применяют следующую систему уравнений (Перт, 1978; Варфоломеев, Гуревич, 1999):

(4.7)

Обозначения здесь те же, что и в системе (4.4), параметр D называется протоком, он численно равен скорости подачи питательной среды (субстрата) в культиватор (ферментер), нормированной на эффективный объем культиватора. Размерность протока – [время^-1] . На практике часто используют соотношения, получаемые из анализа стационарного состояния хемостата (Перт,1978):

. (4.8)

Здесь - стационарная удельная скорость роста популяции, и - стационарные концентрации субстрата и биомассы.

Задача 4.1

Условия: Культуру клеток кишечной палочки E.coli выращивали в аэробных условиях на бедной минеральной среде с глюкозой, содержащей в качестве единственного источника азота хлорид аммония в лимитирующих рост концентрациях. В ходе опыта измеряли концентрацию биомассы клеток и концентрацию лимитирующего субстрата, хлорида аммония (Керридж, Типтон, 1974). Данные представлены в таблице 4.1.

Таблица 4.1.

Концентрация хлорида аммония, S, г/л	Концентрация биомассы клеток, X, г/л	S0 – S г/л	X – X0 г/л
0,10	0,08	0,00	0,00
0,25	0,22	0,15	0,14
0,40	0,32	0,30	0,25
0,50	0,43	0,40	0,35
0,60	0,49	0,50	0,41
0,70	0,59	0,60	0,51

Вопросы: Определить по представленным данным экономический коэффициент Y для хлорида аммония у исследуемой популяции.

Решение: Напомним, что экономический коэффициент Y выражает количественные потребности организмов (клеток) в пище и равен по определению Y = dX/dS, где X и S соответственно концентрации биомассы и изучаемого субстрата. В условиях лимитированного роста популяции, когда субстрат вводится в систему однократно в начале опыта, экономический коэффициент связывает концентрацию субстрата и концентрацию биомассы клеток (организмов) соотношением (4.6):

Используем данное уравнение для решения поставленной задачи. Для этого рассчитаем вспомогательные переменные X – X₀ и S₀ – S, как это указано в таблице 4.1 (3 и 4 столбцы). Далее построим график в этих вспомогательных координатах, используя данные из 3 и 4 столбцов таблицы 4.1 (рис.4.1).

Рис.4.1. Определение экономического коэффициента Y

по данным из таблицы 4.1.

Экспериментальные данные, как видно, группируются около прямой линии, тангенс угла которой равен искомому экономическому коэффициенту. Таким образом, экономический коэффициент для хлорида аммония у исследуемой популяции кишечной палочки равен : Y = 0.834 г биомассы на 1 г хлорида аммония.

Задача 4.2

Условия: С целью определения кинетических параметров, K_S и r_max, и экономического коэффициента Y, характеризующих рост популяции кишечной палочки E.coli на глюкозе, проводили периодическое культивирование клеток E.coli на бедной минеральной среде с лимитированием по данному субстрату до выхода популяции в стационарную фазу. В ходе эксперимента измеряли концентрацию биомассы клеток и концентрацию глюкозы.

Результаты (в интервале от начала экспоненциальной фазы роста до фиксирования стационарного состояния) представлены в табл. 4.2 и на рис.4.2.

Таблица 4.2.

Время,t час	Концентрация биомассы, X мг/л	Концентрация глюкозы, S мг/л	S0 - S	X– X0
0	20	2000	0	0
0,5	30,52	1976	23,4	10,5	0,845299	-0,023515
1	46,6	1940	59,1	26,6	0,845868	-0,030001
1,5	71,1	1886	113,5	51,1	0,845570	-0,038968
2	108,5	1803	196,6	88	0,845508	-0,051755
2,5	165,5	1676	323,3	145	0,845295	-0,070535
3	252,5	1483	516,6	232	0,845226	-0,099618
3,5	385	1188	811,1	365	0,845003	-0,148608
4	587	740	1260	567	0,844823	-0,248563
4,33	773	326	1673	753	0,844006	-0,418467
4,5	885	77	1922	865	0,842190	-0,721565
4,56	918	4,4	1995	898	0,839137	-1,339747
4.564	919	2,2	1997	899	0,838608	-1,490388
5	920	0	2000	900
5,5	920	0	2000	900

Рис.4.2. Изменение концентрации биомассы, X, и концентрации глюкозы, S, в ходе периодического культивирования популяции E.coli.

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, K_S и r_max, и экономического коэффициента, Y, характеризующих рост популяции кишечной палочки E.coli на глюкозе.

Решение: Определим на первом этапе значение экономического коэффициента, как это указано в задаче 4.1.

Рис.4.3. Определение экономического коэффициента Y по данным из таблицы 4.2.

Для этого рассчитаем вспомогательные переменные S₀ – S и X – X₀ (таб.4.2, 4 и 5 столбцы) и построим график в этих координатах, используя данные из 4 и 5 столбцов таблицы 4.2 (рис.4.3). Тангенс угла наклона регрессионной прямой, проведенной через экспериментальные точки, дает значение экономического коэффициента: Y = 0.45. Проверим соответствие данного значения экономического коэффициента экспериментальным данным. Согласно теории стационарное значение концентрации биомассы должно удовлетворять соотношению . Используя данные из таб.4.2 получаем: = 920 мг/л, =20мг/л, =2000мг/л 920 = 0.45*2000 + 20 = 920. Соответствие налицо.

Для определения кинетических параметров, K_S и r_max, используем линейную анаморфозу интегральной формы уравнения клеточного роста (4.5)(Варфоломеев, Гуревич, 1999):

. (4.9)

С этой целью на основе данных из столбцов 1 и 2 таб.4.2 рассчитаем вспомогательные переменные и , как это указано в таб.4.2, столбцы 6 и 7, и построим график в этих координатах (рис.4.4).

Рис.4.4. Определение кинетических параметров роста клеток K_S и r_max по данным из таб.4.2. и рис.4.2

Как видно, экспериментальные данные группируются около прямой линии, точка пересечения которой с осью ординат дает значение = 0.8458 час^-1, а тангенс угла наклона – значение = 0.00485. Отсюда нетрудно рассчитать значения параметров K_S и r_max: K_S = 9.75 мг/л, r_max = 0.85 час^-1.

Задача 4.3

Условия: Исследовали кинетику роста популяции бактерий Pseudomonas fluorescens в хемостате при различных значениях протока D и концентрации лимитирующего субстрата, глюкозы, в подаваемой питательной среде S₀. В каждом случае при достижении стационарного состояния хемостата измерялась концентрация биомассы клеток X и концентрация глюкозы S. Данные измерений представлены в таблице 4.3.

Таблица 4.3.

Концентрация субстрата в подаваемой питательной среде, , мМ	Проток, час-1	Стационар-ная концен-трация биомассы, , г/л	Стационар-ная концен-трация субстрата, , мМ
4	0,1	1,903	0,025	3,97	10	40
4	0,2	1,822	0,056	3,94	5	17,85
4	0,4	1,812	0,168	3,83	2,5	5,95
4	0,6	1,67	0,49	3,51	1,67	2,04
4	0,75	1,041	1,858	2,14	1,33	0,54
8	0,1	1,921	0,025	7,97	10	40
8	0,2	1,892	0,056	7,94	5	17,86
8	0,7	1,67	1,04	6,96	1,43	0,96
8	0,75	1,417	1,875	6,12	1,33	0,53
8	0,8	0,27	7,198	0,80	1,25	0,14
16	0,2	1,882	0,057	15,94	5	17,54
16	0,4	1,89	0,169	15,83	2,5	5,92
16	0,7	1,728	1,038	14,96	1,43	0,96
16	0,75	1,685	1,883	14,12	1,33	0,53
16	0,8	1,093	7,095	8,90	1,25	0,14

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, K_S и r_max, и экономического коэффициента, характеризующих рост в хемостате популяции бактерий Pseudomonas fluorescens в указанных условиях.

Решение: Используем для решения поставленной задачи известные из теории хемостата соотношения (4.8), описывающие стационарное состояние культуры клеток (Перт, 1978):

.

Для определения экономического коэффициента применим второе соотношение, предварительно произведя расчет вспомогательной переменной (таб.4.3, 5-ый столбец) и представив данные из таблицы (3 и 5 столбцы) в координатах { , }. Графики будем строить отдельно для каждого значения . На рис.4.5 представлены данные и расчет экономического коэффициента для = 4 мМ. Как видно, для данной концентрации Y₁ = 0.45 г/мМ.

Рис.4.5. Определение экономического коэффициента Y₁ по данным из таб.4.5 для = 4 мМ

Аналогично находим значения экономического коэффициента для двух других начальных концентраций лимитирующего субстрата (рис.4.6.): Y₂ = 0.23 г/мМ и Y₃ = 0.11 г/мМ.

Рис.4.6. Определение значений экономического коэффициента по данным из таб.4.5 для = 8 мМ (Y₂) и = 16 мМ (Y₃)

Для определения кинетических параметров роста клеток, K_S и r_max, используем линейную анаморфозу первого из вышеуказанных соотношений (Перт, 1978):

. (4.10)

С этой целью рассчитаем вспомогательные переменные, и , как это указано в таб.4.4, столбцы 6-ой и 7-ой, и, далее, для каждого значения построим график в этих координатах. Экспериментальные данные должны сгруппироваться около прямой линии, которая отсекает на оси абсцисс значение , а на оси ординат – значение . На рис.4.8 (вверху) представлены данные для = 4 мМ. Произведенный расчет дает следующие значения для искомых кинетических параметров: r_max = 0.82 час^-1, K_S= 0.17 мМ.

Рис.4.8. Определение кинетических параметров роста клеток K_S и r_max по данным хемостатного культивирования для = 4 мМ (вверху), а также для = 8 мМ и = 16 мМ (внизу) на основе данных из таб.4.3

Из нижнего графика на рис.4.8 следует, что значения K_S и r_max для для = 8 мМ и = 16 мМ идентичны и равны таковым для = 4 мМ.

Таким образом, из полученных результатов следует, что при хемостатном культивировании исследуемых бактерий на глюкозе как лимитирующем субстрате увеличение ее начальной концентрации с 4 мМ до 16 мМ существенно снижает экономический коэффициент с 0.45 до 0.11 г/мМ и не влияет на значения кинетических параметров роста K_S и r_max, которые соответственно равны r_max = 0.82 час^-1, K_S = 0.17 мМ. По-видимому, это свидетельствует о переключении типа энергетического метаболизма с полностью затратного на запасающий и неизменности транспортных систем для глюкозы.

Задача 4.4

Условия: Исследовали динамику популяции кишечной палочки E.coli при культивировании в хемостате на бедной минеральной среде при лимитировании глюкозой, начальная концентрация которой в подаваемой среде (S₀) составляла 0.666 г/л. Изучали поведение популяции во время переходного процесса, обусловленного изменением протока через ферментер с величины D_исх = 0.25 час^-1 на величину D = 0.765 час^-1. В ходе эксперимента определяли концентрацию биомассы клеток и концентрацию глюкозы. За нулевую отметку времени был взят момент смены протока. Данные представлены в таблице 4.4 и на рис.4.9 (Евдокимов и др., 2000).

Таблица 4.4

Время, t, час	Концентрация биомассы, X, г/л	Концентрация субстрата, S, г/л
0	0,166	0,198	0,468
1	0,142	0,297	0,369	-0,15644	-0,18693
2	0,116	0,326	0,34	-0,17799	-0,21741
3	0,099	0,396	0,27	-0,17175	-0,21418
4	0,095	0,446	0,220	-0,13984	-0,1755
5	0,078	0,446	0,220	-0,15167	-0,1966
10	0,064	0,506	0,16	-0,09531	-0,12852
14	0,058	0,509	0,157	-0,07511	-0,10373
24	0,049	0,531	0,135	-0,05084	-0,07378
30	0,039	0,586	0,08	-0,04828	-0,07699
48	0,025	0,594	0,072

Рис.4.9. Изменение концентрации биомассы клеток кишечной палочки при культивировании в хемостате при изменении протока: 0.25 час^-1 0.765 час^-1.

Стрелкой указан момент изменения протока.

Вопросы: Определить по представленным данным значения кинетических параметров, K_S и r_max, и экономического коэффициента, характеризующих рост в хемостате популяции бактерий E.coli в указанных условиях переходного процесса.

Решение: На первом этапе определим среднее значение экономического коэффициента в ходе процесса, исходя из предположения, что он изменяется несущественно при смене протока. Для этого воспользуемся подходом, рассмотренным в предыдущей задаче. Вспомогательная переменная представлена в 4-ом столбце таб.4.4, а решение – на рис.4.10.

Как видно, экспериментальные данные достаточно компактно группируются около прямой линии. Это свидетельствует о том, что в течение переходного процесса изменения концентрации биомассы и субстрата связаны таким же соотношением, как и в стационарном состоянии: , и среднее значение экономического коэффициента = 0.35 достаточно стабильно.

Рис.4.10. Определение среднего значения экономического коэффициента по данным из таб.4.4

Для определения кинетических параметров, K_S и r_max, используем следующую теорию, развитую в работе (Евдокимов, Шаповалов, 2000). Согласно это теории, если хемостатная культура клеток находится в стационарном состоянии при протоке D_исх, и далее проток изменяется D_исх D, то начиная с момента смены протока динамика системы описывается следующим уравнением:

, (4.11)

где и - стационарная концентрация биомассы при протоке D. Уравнение (4.11) будем использовать в виде следующей линейной анаморфозы:

. (4.12)

При расчете вспомогательных переменных, и , (таб.4.4, столбцы 5-ый и 6-ой), применялись следующие значения начальной и стационарной концентраций биомассы клеток: =0.166 мг/л и =0.025 мг/л. Экспериментальные данные, представленные в указанных координатах, как видно из рис.4.11, группируются около прямой линии, которая согласно выражению (4.6), отсекает на оси ординат значение , а тангенс угла ее наклона дает значение .

Рис.4.11. Определение кинетических параметров роста клеток K_S и r_max по данным хемостатного культивирования на основе данных из таб.4.4

Далее, решая найденные соотношения как систему уравнений с двумя неизвестными, легко найти искомые значения кинетических параметров: r_max = 0.8 час^-1, K_S = 13.6 мг/л.

Задача 4.5

Условия: Исследовали кинетику потребления энергетического субстрата, глюкозы, при росте популяции кишечной палочки E.coli в хемостате в стационарных условиях. Опыты проводили при различных начальных концентрациях глюкозы и значениях протока. В ходе эксперимента измеряли стационарные концентрации биомассы и глюкозы. Данные представлены в таблице 4.5.

Таблица 4.5

Начальная концентрация глюкозы, S0, мМ	Проток, D, час-1	Стационарная концентрация биомассы, , г/л	Стационарная концентрация глюкозы, , мМ	Y
4	0,1	1,74	0,03	0,438	10	2,28
4	0,2	1,93	0,06	0,49	5	2,04
4	0,4	2	0,18	0,524	2,5	1,91
4	0,6	1,88	0,49	0,536	1,67	1,87
4	0,75	1,13	1,91	0,541	1,33	1,85
8	0,1	1,96	0,03	0,246	10	4,07
8	0,2	2,08	0,06	0,262	5	3,82
8	0,7	1,92	1,02	0,275	1,43	3,64
8	0,75	1,68	1,88	0,275	1,33	3,64
8	0,8	0,28	6,98	0,274	1,25	3,64
16	0,2	2,16	0,06	0,136	5	7,38
16	0,4	2,18	0,17	0,138	2,5	7,26
16	0,7	2,08	1,01	0,1388	1,43	7,21
16	0,75	1,96	1,86	0,1386	1,33	7,21
16	0,8	1,26	6,94	0,1390	1,25	7,19

Вопросы: Определить по представленным данным значения ростового экономического коэффициента Y_рост и трат на поддержание m, характеризующих кинетику потребления энергетического субстрата, глюкозы, при росте популяции бактерий E.coli в хемостате в указанных условиях.

Решение: На первом этапе решения определим для каждого варианта условий значение суммарного экономического коэффициента Y. Для расчетов Y (5-ый столбец таб.4.5.) будем использовать соотношение (4.8) в виде и данные из 1-го, 3-го и 4-го столбцов таб.4.5.

В соответствии с теорией суммарный экономический коэффициент Y, ростовой экономический коэффициент Y_рост и траты на поддержание m связаны соотношением (4.2):

.

Учитывая, что в стационарном состоянии в хемостате удельная скорость роста популяции r равна протоку D , будем использовать

соотношение (4.2) в виде:

. (4.13)

Рис.4.12 - 4.13. Определение ростового экономического коэффициента Y_рост и трат на поддержание m по данным из таб.4.5 для S₀ = 4 мМ (вверху) и S₀ = 8мМ (внизу)

С этой целью рассчитаем вспомогательные переменные и (столбцы 6-ой и 7-ой таб.4.5) и построим графики в этих координатах для каждого значения начальной концентрации глюкозы S₀ (рис.4.12-4.14).

Экспериментальные данные на этих графиках группируются около прямых линий, которые согласно выражению (4.13) отсекают на оси ординат значение 1/Y_рост, а тангенсы угла наклона дают значения m.

Рис.4.14 . Определение ростового экономического коэффициента Y_рост и трат на поддержание m по данным из таб.4.5 для S₀ = 16 мМ

Полученные в результате значения ростового экономического коэффициента и трат на поддержание представлены в таб.4.6.

Таблица 4.6

Начальная концентрация глюкозы, S0, мМ	Ростовой экономический коэффициент, Yрост , г/мМ	Траты на поддержание, m, час-1
4	0,56	0,05
8	0,28	0,049
16	0,14	0,048