47 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов, ртбл.

Реакция бласттрансформации РТБЛ

Для оценки функционального состояния Тл чаще всего используют фетогемааглютинаци (ФГА) растительный лектин, получаемый из семян фасоли. Мононуклеарные лейкоциты выделенные из периферической крови методом градиентного центрифугования культивируют в присутствии ФГА в течении 72 часов.

Ход реакции: К 0,1 -0,2 мл отмытых лимфоцитов (1-1,5 х 106 мл) + 20% инактивированной сыворотки (пул от нескольких доноров IV группа) + 199 среда с антибиотиками + митоген (или антиген в оттитрованых дозах). Инкубируют при 37 С 3 суток (5 суток в зависимости от вида антигена или митогена) в инкубаторе с СО2.

Учёт реакции: Морфологическим методом либо с помощью сцинтилляционного подхода. Неспецифический митоген ФГА трансформируют в бласты 70 -80% Т-клеток. Под влиянием специфических АГ бласты трансформируются не более 7-12% малых лимфоцитов.

Морфологический метод – готовят мазки, фиксируют в метаноле, окрашивают по Романовскому-Гимзе. В световом микроскопе с иммерсионной системой определяют % бластных клеток, по отношению к общему количеству лимфоцитов. Результат может быть выражен в виде индекса стимуляции (ИС) – отношение % трансформированных клеток в опыте (культура с ФГА) к % трансформированных клеток в контроле (культура без ФГА)

Сцитилляционный метод Культивирование клеток проводят в 96 луночных планшетах с объёмом ленки примерно 200 мкл. В каждую лунку достаточно внести 50000 клеток что в пересчёте на цельную кровь составляет 0, 05мл (*т.о. сокращается количество крови на исследование). За 4-6 часов до окончания культивирования в лунки вносят 3Н - тимидин. Далее с помощью специального прибора клетки переносят на стеклянные фильтры, избыток метки смывают большим количеством воды, фильтры высушивают и помещают во флаконы со сцитилляционной жидкостью.

Уровень включения метки оценивают на сцинтилляционном счётчике. Результаты выражают в импульсах в мин. Или в виде индекса стимуляции.

Метод высокочувствителен но вытесняется иммуноферментным анализом, учитывая небезопасность работы с радиоактивными изотопами и необходимость в сложном регистрирующем оборудовании.

48 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов. Реакции торможения миграции лейкоцитов (ртмл) Методы оценки продукции цитокинов

Оценка гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

ГЗТ – это форма гиперчувствительности наблюдается при многих аллергических реакциях на бактерии, вирусы и грибы, а также при контактном дерматите, возникающем в результате сенсибилизации определёнными простыми химическими соединениями, и при отторжении трансплантированных тканей.

Для оценки ГЗТ используют реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) которая является пробирочным аналогом клеточных иммунных реакций ГЗТ определяемых in vivo (кожные пробы). Сущность реакции – в присутствии антигенов лимфоциты выделяют лимфокины, в частности, фактор подавляющий миграцию лейкоцитов.

1. Реакции in vitro – РТМЛ

Ход реакции

В взвеси лейкоцитов добавляют АГ (можно митоген – ФГА) и заполняют ею капиллярные трубочки (контроль – без АГ). Капилляры помещают в камеры или лунки, запол6ненные питательной средой. После инкубации при 37 С 18-20 часов измеряют зону миграции клеток из капилляров или подсчитывают их количество. Если есть иммунные клетки (т.е. организм сенсибилизирован к АГ) то миграция клеток подавляется.

Другой вариант реакции под агарозой. Пластиковые чашки Птери заливаются агарозным гелем. После застывания агарозы формируются с помощью специального пробойника лунки, в котрые вносится взвесь лейкоцитов: в опытные – взвесь лейкоцитов + митоген/антиген; в контрольные – взвесь лейкоцитов. После инкубации – учёт реакции.

Учёт реакции: измеряется зона миграции клеток в контроле и в оптыте и высчитывается индекс миграции:

Индекс миграции = диаметр миграции в К – диаметр миграции в О +100/ диаметр миграции в К

Оценка интенсивности продукции цитокинов

Проводится с помощью методов иммунного определения цитокинов в сыворотке крови, других биологических жидкостях (например ИЛ -1, ФНО –а в синовмальной жидкости при ревматоидном и реактивном артритах), а также в супернатанте культур стимулированных клеток (моноцитов, макрофагов, лимфоцитов) Этот подход позволяет не только оценить уровень соответствующих цитокинов и способность клеток вырабатывать их, он даёт возможность сопоставить активность двух типов Т хелперов – ТХ1 и Тх2 что должно в значительной степени обуславливать тактику иммуномодулирующих воздействий.

Определение цитокинов в супернатантах стимулированных культур имеет недостаток – необходимость культивирования клеток в стерильных условиях.

Исследования проводят по след. Схеме. Моноклеары периферической крови, выделенные методом градиентного центрифугования, культивируют в культуральных планшетах в течение 16-18 часов в присутствии ФГА или других митогенов. Недостаточную жидкость собирают и определяют в ней содержание цитокина. Для этого используют либо ИФА, либо цитокинзависимые клеточные линии (принцип определения основан на том, что клеточная линия способна размножаться только в присутствии определённого цитокина, например ИЛ-2 – линия СТLL-2, ИЛ-6 – линия Д6С8).