45 Моноклональные антитела. Практическое применение в иммунологии.

Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны против почти любого природного антигена (в основном белки и полисахариды), который антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. 

Получение моноклональных Антител

В 1973 году была описана методика позволяющая получить гибридомы – бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела с желаемой антигенной специфичностью (моноклональные АТ).

Все молекулы Ig, продуцируемые определённой гибридомой идентичны они относятся к одному классу и одному агглютину, имеют одну структуру, аффинность и специфичность.

На современном этапе созданы десятки тысяч высокоаффинных АТ связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, АГ.

Получение гибридом

Получают при слиянии нормальных Bл продуцирующих антитела АОК с подходящей опухолевой линией В клеток. Путём множественных пересевов получают одиночные клоны, которые можно выращивать в брюшной полости мышей.

Применение моноклональных АТ

Прямой метод РИФ

Используется для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале.

Из материала готовят мазок. На поверхность наносят моноклональные АТ меченые флююрохромом.

Учёт результатов осуществляется с помощью люминисцентного микроскопа в оптическую систему которого устанавливается система светофильтров.

Исследователь оценивает характер свечения форму и размер объектов и их взаимное расположение.

Непрямой метод РИФ

Данный метод используется для серодиагностики (например при болезни лайма).

Для серодиагностики готовят мазки из эталонного источника АГ возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые АТ то они связываются с АГ микробных клеток. Оценивается по свечению эталонной культуры.

Критерии специфичности РИФ

1) Характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке.

2) Периферический характер свечения объектов

3) Цвет флюорисценции

4) Интенсивность флюорисценции.

46 Методы определения популяций и субпопуляций клеток. Метод магнитной сепарации клеток. Иммунофенотипирование клеток (СД панель), проточная цитометрия.

Проточная цитометрия

Клеточная суспензия предварительно меченая флюорисцирующими АТ или флюорисцентными АТ или флюорисцентными красителями пропускаются по тонкой трубке через проточную ячейку. Условия подобранны таким образом что клетки выстраиваются в струю друг за другом. Через струю клеток пропускают лазер который способствует свечению флююрохромов. Рассеяние света под малыми углами используют для определения размеров клеток.

Рассеяние света под углом 90 гр. Позволяет судить о состоянии ядерно цитоплазматического соотношения и гранул в клетках.

Активность флюорисценции по 4 каналам флюорисцентности позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии.

Преимущества проточной цитометрии

Короткое время анализа

Анализ большого количества клеток

Возможность определения субпопуляции клеток

Измерение параметров редко встречающихся клеток

Магнитная сепарация клеток

Технология основана на применении парамагнитных полистирольных микрочастиц, покрытых антителами к специфическим антигенам. Это частицы связанные с моноклональными АТ высокоспецифическими по отношению к некоторым поверхностным маркёрам. Частицы добавляются к образцу биологической жидкости. После 10-20 минутной инкубации пробирка с образцом помещается в магнитный сепаратор где клетки разделяются.

Негативное выделение клеток осуществляется при удалении всех нежелательных кл. популяцийиз образца моноклеарной суспензии. Для суспензии клеток используются частицы конъюгирующие с АТ специфичными по отношению поверхностного маркёра целевой клеточной популяции.

Иммунофенотипирование - метод, основанный на реакции антител с антигенами и используемый для определения специфических типов клеток в образцах крови, костного мозга или лимфатических узлов. К антителам, которые реагируют со специфическими антигенами клеток, присоединена особая метка. Эту метку можно обнаружить с помощью специальных приборов. Клетки, несущие совокупность антигенов, помечают специфическими антигенами, и это дает возможность идентифицировать такие помеченные клетки. Например, клетки миелоидного лейкоза можно отличить от клеток лимфоцитарного лейкоза. Этот метод помогает субклассифицировать типы клеток, что, в свою очередь, облегчает принятие решений о наиболее эффективном лечении конкретного типа лейкоза или лимфомы.