72,73Хемилюминесцентный анализ в биохимии и медицине. Хемилюминесцентный анализ в оценке функций иммунокомпетентных клеток и в оценке свободнорадикальных процессов.
Сверхслабое свечение живых объектов Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что стало главным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. В присутствии определенных соединений, активаторов ХЛ, хемилюминесценция при реакциях активных форм кислорода и пероксидации липидов может быть усилена в тысячи и сотни тысяч раз. В основе биолюминесценции лежат химические превращения особых веществ (люциферинов) под действием специальных ферментов (люцифераз). Как хемилюминесценция, так и биолюминесценция находят широкое применение в аналитической биохимии, в частности, в клиническом биохимическом анализе.Активированная хемилюминесценция
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения" [1]. Это оказалось главным и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях. Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной литературе общее название "активаторов", а за рубежом – "усилителей" (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами [2]. Химические активаторы ХЛ – это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов:
Активатор + радикалы -> продукт* -> продукт + фотон |
Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)]. На рис.1 дана упрощенная схема превращений люминола в присутствии радикалов кислорода. Под действием окислителя, в нашем случае – радикала гидроксила, происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:
Радикалы -> продукт* -> продукт + фотон 1 |
(неактивированная ХЛ) |
Продукт* + активатор -> продукт + активатор* -> фотон 2 |
(активированная ХЛ) |
Интенсивность свечения в большой степени зависит от квантового выхода люминесценции продукта реакции, т.е. от того, какая часть возбужденных молекул продукта перейдет в основное, невозбужденное состояние с испусканием фотона. Обычно эта доля невелика, всего десятые или даже сотые доли процента. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулам активатора, то интенсивность свечения будет теперь определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице. (Подробнее с этим вопросом можно ознакомиться в соответствующих руководствах, например [3]). К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов. Измерение этой хемилюминесценции пока еще не стало рутинным лабораторным методом в значительной мере из-за ее низкой интенсивности. Поэтому ведется поиск веществ, усиливающих "липидную" ХЛ. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции. Так, например, комплекс редкоземельного иона европия (Eu3+) с антибиотиком хлортетрациклином усиливает ХЛ при окислении липидов почти в 1000 раз. Один из красителей, производное кумарина, применяемое при создании лазеров под условным названием С-525, усиливает хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Формула этого вещества приведена на рис.2. Активируют свечение (правда, в меньшей степени) и такие известные красители как родамин Ж6, нильский красный и нильский синий, а также некоторые порфирины. Все эти активаторы не оказывают влияния на ход реакций перекисного окисления, но заметно увеличивают интенсивность свечения. По-видимому, в основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции (например, кетона) на активатор:
LOO· + LOO· -> LOH + L=O* + O2 |
L=O* -> L=O + hn1 (слабое свечение; j = 10-4) |
L=O* + А -> L=O + А* (перенос энергии) |
А* -> А + hnA (яркое свечение; j = 10-2 - 10-1) |
Интенсивность свечения в присутствии активатора во много раз выше, чем без него, по той причине, что квантовый выход j люминесценции активатора (А) выше квантового выхода люминесценции продукта реакции (Р). Было также показано, что спектр активированной хемилюминесценции в изученных случаях был сходен со спектром фотолюминесценции активатора, т.е. его люминесценции при освещении ультрафиолетовыми лучами.Использование активированной ХЛ в биохимических анализахОбнаружение катализаторов, разлагающих перекись водорода с образованием свободных радикалов
Чистая перекись водорода с люминолом реагирует вяло, и хемилюминесценция при этом не наблюдается. Если перекись водорода разлагается ферментативным путем, например, при действии каталазы, свободные радикалы не образуются и свечение также не возникает. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как железо, медь или марганец, а также некоторых их комплексов, например, производных гема, перекись водорода разлагается с образованием радикалов (гидроксила и супероксида) и возникает яркое свечение, связанное с реакциями люминола. По этой причине хемилюминесценция в присутствии люминола часто используется для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода. Приведем два примера. У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985, цит. По [1]). На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза – фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [4].Люминесценция фагоцитов
В рассмотренных случаях радикалы кислорода образовывались при разложении перекиси водорода, добавленной экспериментатором. Но живые клетки – фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги) сами образуют активные формы кислорода при их стимулировании. При этом наблюдается хемилюминесценция, особенно яркая в присутствии люминола (или люцигенина). На рис.3 (А) в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же "хемилюминесцентные ответы" можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название "стимулов". Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола – ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются. Два результата таких исследований даны в качестве примера на рис.3 (Б) и 4. Как видно на рис.3(Б) у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится очень много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза) ХЛ ответ клеток на стимул почти в четыре раза превышает ответ клеток здоровых доноров. Назначенное лечение – облучение крови ультрафиолетовым светом (УФ-ОК) оказалось малоэффективным, если верить данному показателю. В Институте Физико-химической медицины М. П. Шерстневым было проведено обследование большой группы больных различными заболеваниями (рис.4). При затяжных хронических заболеваниях свечение клеток снижалось, тогда как при возникновении или обострении воспалительного процесса у больных происходило резкое увеличение активности клеток-фагоцитов. Так встречает организм инфекционную опасность – усиливается способность фагоцитов выделять активные формы кислорода для борьбы с чужеродными микроорганизмами. Хотя люминесценция люминола – весьма чувствительный метод обнаружения радикалов кислорода, метод не очень специфичен. Свечение наблюдается при действии на люминол не только радикалов гидроксила, но и при действии гипохлорита и ряда других окислителей. Заметный вклад в ХЛ-ответ клеток вносит выделение окиси азота: ингибитор NO-синтазы (фермента катализирующего образование окиси азота в клетках) уменьшает свечение почти вдвое. Большей избирательностью отличается люцигенин, свечение которого происходит при восстановлении красителя супероксидными радикалами. Это соединение часто используется для изучения образования супероксидных радикалов различными клетками и при биохимических реакциях "в пробирке".Хемилюминесцентный иммунный анализ
По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченнных субстратов или антител используются субстраты и антитела, "меченнные" соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По-русски это соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-ХемилюминоМетрический Анализ). Оба метода направлены на определение биологически-важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах. При использовании метода CIA (см. рис.5, А) к раствору, содержащему интересующее нас анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное количество того же, но ХЛ-меченнного соединения (обозначим его как A*) и антитела (анти-А). Образуется смесь меченнных и немеченнных иммунных комплексов (A-анти-A и A*-анти-А, соответственно):
A + A* + анти-A -> A-анти-A + A*-анти-A |
Очень важно, что пропорция между меченнным и немеченным иммунными комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и сколько немеченного было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было немеченного антигена, тем меньше доля меченных антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество A*-анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченных антигена A (т.е. анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, т.е. измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию A. При использовании метода ICMA (рис.5, Б) берут избыток ХЛ-меченнного антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-меченнный иммунный комплекс:
A + анти-A* -> A-анти-A* |
Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем меньше было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую. В обоих методах одна из практических трудностей – это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. рис.5, В), к поверхности которого "пришиты" (т.е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченного антигена.Биолюминесценция
Биолюминесценция (БЛ) – это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой.Биолюминесценция светляка
Всем известное свечение светлячков происходит в результате биохимической реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):
|
Здесь AMP – аденозинмонофосфат, PP – пирофосфат, E – люцифераза, LH2 – люциферин, P* и P – продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях, соответственно. В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии. Удается определять содержание АТФ в образце от 10-17 моля и выше. Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т. д. В последнее время используют препараты иммобилизованной люциферазы (т.е. фермента, молекулы которого химически связаны с полимерной пленкой), стабильность которой выше; такой препарат можно использовать многократно.
74Спектроскопия комбинационного рассеяния (рамановская спектроскопия комбинационное рассеяние света сокр., КР; КРС иначе эффект комбинационного рассеяния; рамановское рассеяние; эффект Рамана (англ.Raman effect или Raman scattering) — неупругое рассеяние света (с изменением частоты/длины волны), сопровождающееся переходами вещества между колебательными уровнями энергии.Рассеяние света, при котором происходит обмен энергией между фотонами и веществом, называется неупругим рассеянием или комбинационным рассеянием (эффектом Рамана). Следствием изменения энергии фотонов является изменение длины волны (частоты) рассеянного света. Наблюдается также упругое рассеяние света веществом, без изменения энергии фотонов и, следовательно, длины световой волны. Пример упругого рассеяния — релеевское рассеяние света (эффект Релея).Механизм комбинационного рассеяния (КР) поясняет рис. 1. Стоксово КР характеризуется тем, что в процессе взаимодействия с молекулой фотон отдает ей часть энергии. В результате такого процесса молекула переходит с уровня с меньшим значением энергии на уровень с более высоким значением энергии, а энергия рассеянного фотона уменьшается (длина волны увеличивается (рис. 1, слева)). Антистоксово КР характеризуется тем, что в процессе взаимодействия с молекулой, находящейся в возбужденном состоянии, энергия фотона увеличивается, а молекула переходит в состояние с меньшим значением энергии (рис. 1, справа). Для сравнения на рис. 1 в центре приведена диаграмма, соответствующая релеевскому рассеянию, когда обмена энергией между фотоном и молекулой не происходит. На рис. 1 б также показан виртуальный уровень энергии молекулы в поле световой волны (верхняя пунктирная линия).Так как при термодинамическом равновесии заселенность уровней уменьшается с увеличением энергии, то при спонтанном КР частота антистосковых переходов меньше частоты стоксовых — поэтому интенсивность стоксовых линий КР в спектре выше. Стоксовы линии КР расположены в спектре с «красной» стороны (со стороны больших длин волн/меньших частот) от релеевской линии. Не все переходы между различными колебательными энергетическими уровнями возможны.Интенсивность комбинационного рассеяния (КР) на 3–6 порядков ниже релеевского, поэтому для наблюдения КР спектров требуется интенсивный источник монохроматического излучения и высокочувствительный детектор. В настоящее время в качестве источников излучения, главным образом, используют лазеры. КР-спектроскопия может быть использована для изучения структуры и состава вещества, его взаимодействия с окружающей средой. Полосы комбинационного рассеяния можно характеризовать частотой, интенсивностью и степенью деполяризации излучения. При облучении оптически анизотропных молекул поляризованным светом рассеянный свет окажется частично деполяризованным.Когда частота возбуждающего света приближается и совпадает с частотой оптического перехода системы, реализуется ситуация резонансного КР (РКР). Спектральные особенности КР света дают информацию о типе структуры и взаимодействии электронной и фононной подсистем в полупроводниках.КР света в конденсированных средах обладает рядом особенностей, так как в твердых телах колебания молекул (атомов, ионов) сильно коррелированны и, в случае кристаллов, их следует рассматривать как колебания кристаллической решетки в целом.Спектры КР света аморфных твердых тел более «размыты», чем кристаллических — из-за разупорядочения структуры и уменьшения областей пространственных корреляций между колебаниями частиц (рис. 2). Наблюдается заметное уширение линий и в КР спектрах твердых растворов и высокодефектных кристаллов.К уширению линий спектров может приводить ориентационное разупорядочение твердых тел, связанное с вариациями ориентации молекул в молекулярных кристаллах, диполей в сильно полярных кристаллах, свободных электронных пар в ионах типа Pb2+. Смещение линий КР спектров силикатных стекол служит мерой степени полимеризации силикатных сеток.Спектроскопия КР является очень информативным методом для исследованиянаноматериалов, в частности, углеродных нанотрубок: можно определить их геометрические параметры, тип проводимости и т. д.При нагревании веществ интенсивность антистоксовых линий КР заметно возрастает (в отличие от стоксовых), что позволяет использовать этот эффект для измерения температуры (разработаны соответствующие волоконно-оптические датчики).При возбуждении КР источниками большой мощности вероятность стоксова рассеяния возрастает, и возникает вынужденное комбинационное рассеяние (ВКР). В волоконно-оптической связи широко используют ВКР усилители. ВКР лазеры позволяют получать мощное когерентное излучение в спектральных диапазонах, в которых нет эффективных лазеров другого типа
75.Твердофазная спектрофотометрия является современным гибридным методом нализа, рационально сочетающим концентрирование и последующее прямое измерение светопоглощения сорбента после сорбции им определяемого элемента. Метод ТСФ привлекателен в связи с неограниченными возможностями сочетания органических реагентов и различных сорбентов. ТФС была предложена в 1976 году. Авторами было показано, что даже при толщине сорбента 0,1 см чувствительность определении повышается в 10 раз по сравнении с аналогичными измерениями в растворах..Метод я́дерного га́мма-резона́нса (Мёссбауэровская спектроскопия) основан на эффекте Мёссба́уэра, который заключается в резонансном поглощении без отдачи атомным ядром монохроматического γ-излучения, испускаемогорадиоактивным источником. В абсорбционной мёссбауэровской спектроскопии (наиболее часто применяемой разновидности метода) образец-поглотитель просвечивается гамма-квантами, излучаемыми возбуждённым железом-57 (57Fe),иридием-191 (191Ir) или другим мёссбауэровским изотопом. За поглотителем располагается детектор, с помощью которого измеряется коэффициент поглощения γ-квантов образцом. Образец должен содержать такие же ядра (57Fe, 191Ir и т. д.). Возбуждённые ядра в источнике создаются при распаде соответствующего радиоактивного изотопа (например, 57Co, превращающийся в возбуждённое состояние 57Fe)В обычных условиях ядро, излучающее гамма-квант, приобретает импульс отдачи (что приводит к некоторому уменьшению энергии γ-кванта); поглощающее ядро, захватив гамма-квант, также приобретает импульс отдачи. Как следствие, взаимная «точная настройка» источника и поглотителя сбивается на сотые доли электронвольта, что очень мало по сравнению с типичной энергией гамма-кванта (от десятков кэВ до МэВов), но чрезвычайно много по сравнению сестественной шириной уровня (микроэлектронвольты). Однако ядра всё-таки можно настроить в резонанс друг с другом, поместив их в кристаллическую решётку при достаточно низкой температуре. Импульс отдачи ядра воспринимается кристаллической решеткой образца и источника (т. е. макроскопическими объектами), в результате доплеровский сдвиг гамма-линий становится пренебрежимо малым (значительно меньшим, чем естественная ширина гамма-линии). Благодаря этому обстоятельству, небольшое изменение относительной скорости источника и поглотителя (порядка см/с) позволяет сканировать тонкую структуру уровней ядра, которая зависит от его химического окружения. Зависимость коэффициента поглощения образца от относительной скорости движения источника и образца (т. е. от энергии поглощаемого гамма-кванта) называется мёссбауэровским спектром поглощения. Этот спектр позволяет судить об электронной структуре атома в исследуемом веществе, окружающих группах и о характере их взаимодействий.Метод ядерного гамма-резонанса используется в физическом материаловедении, химии и биологии (например, при анализе свойств Fe-содержащих групп в белках). Эффект поглощения излучения усиливают путём обогащения образца мёссбауэровскими изотопами, повышая, например, содержание 57Fe в пище подопытных животных. Одним из впечатляющих применений метода стал эксперимент Паунда и Ребки, которые в 1960 г. измерили в лабораторных условиях гравитационное смещение гамма-квантов, предсказываемое общей теорией относительности.
Фурье-спектроскопия (англ. Fourier-transformed spectroscopy сокр., FT spectroscopy) — метод оптической спектроскопии, позволяющий получать спектр в результате обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по частоте).Комплекс аппаратуры, выполняющий эти операции, называется Фурье-спектрометром (ФС). В него, как правило, кроме двухлучевого интерферометра входят осветитель, детектор излучения, усилитель, аналогово-цифровой преобразователь и ЭВМ.Интерферометр содержит два взаимно перпендикулярных зеркала — неподвижное и подвижное, и полупрозрачную светоделительную пластину, расположенную в месте пересечения падающих пучков излучения и пучков, отраженных от обоих зеркал. Пучок излучения от источника, попадая на пластину, разделяется на два. Один из них направляется на неподвижное зеркало, второй — на подвижное зеркало; затем оба пучка, отразившись от зеркал, выходят через светоделитель из интерферометра в одном и том же направлении. Далее излучение фокусируется на образце и поступает на детектор излучения. Два пучка отличаются друг от друга оптической разностью хода, величина которой меняется в зависимости от положения подвижного зеркала. В результате интерференции пучков интенсивность результирующего светового потока периодически меняется (модулируется). Частота модуляции зависит от частоты падающего излучения и смещения подвижного зеркала.Будучи значительно сложнее обычных спектрометров, Фурье-спектрометры обладают рядом преимуществ над другими спектральными приборами.1. С помощью ФС можно регистрировать одновременно весь спектр. Благодаря тому, что в интерферометре допустимо входное отверстие больших размеров, чем щель спектральных приборов с диспергирующим элементом такого же разрешения, Фурье-спектрометры по сравнению с ними имеют выигрыш в светосиле, что позволяет:
уменьшить время регистрации спектров;
увеличить отношение сигнал–шум;
повысить разрешение;
уменьшить габариты прибора.
2. ФС выигрывают в точности отсчета длины волны, поскольку в дифракционных приборах длину волны можно определить только косвенно, а интерферограмма Фурье-спектрометра позволяет измерить длину волны напрямую.Чаще всего ФС применяются в тех исследованиях, где другие методы малоэффективны или неприменимы, например. В частности, наибольшее распространение получили ИК-Фурье спектрометры, предназначенные для быстрого получения колебательных спектров в ИК-области излучения.
76.ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
-
совокупность спектральных методов в
видимой и ИК-областях спектра, основанных
на применении лазерных источников
излучения. Использование лазеров,
излучение к-рых обладает высокой
интенсивностью, монохроматичностью и
малой расходимостью пучка, резко повысило
возможности традиционных методов
спектроскопии. Кроме того, применение
лазеров позволило создать методы,
основанные на принципиально новых физ.
принципах, существенно изменилась и
эксперим. техника. Разрешающая способность
оптич. спектроскопии возросла более
чем в миллион раз, чувствительность
доведена до предельного уровня,
ограниченного регистрацией единичных
атомов или молекул, появилась возможность
исследовать релаксационные процессы
в конденсированных средах, происходящие
в течение 
10-12-
10-14 с,
и проводить дистанционный спектральный
анализ на больших расстояниях до объекта.
Применение методов Л. с. выходит за рамки
чисто аналитических, они используются
в физ. оптике, лазерном разделении
изотопов и лазерной
химии, при
создании оптических
стандартов частоты и
т. д.При взаимодействии с веществом
лазерного излучения, благодаря его
высокой интенсивности и монохроматичности,
в среде возникают разл. нелинейные
явления. Наиб. простой и важный нелинейный
процесс связан с возникновением насыщения
населённостей уровней энергии системы
за счёт вынужденных переходов, к-рая
имеет место в основном для частиц,
резонансно взаимодействующих с полем.При
неоднородном уширении спектральной
линии эффекты насыщения приводят к
возникновению неравновесного распределения
частиц на уровнях. Оно может быть
зарегистрировано с помощью пробного
поля, частота к-рого плавно изменяется.
В результате линия поглощения пробного
сигнала содержит резкие структуры с
однородной шириной. На этом эффекте
основана Л. с. насыщенного поглощения.
Т. к. однородная ширина линии может быть
на много порядков уже неоднородной
ширины, то использование этого метода
позволило резко повысить разрешающую
способность спектроскопии.Один из
нелинейных процессов, используемых в
Л. с., обусловлен нелинейной восприимчивостью
среды, к-рая приводит к появлению
поляризации в среде на гармониках
излучения. При взаимодействии излучения
на н'еск. частотах возникает поляризация
на суммарной, разностной и комбинационных
частотах. При многофотонных процессах
резонансные особенности возникают,
когда сумма частот поглощённого фотона
равна частоте перехода между реальными
уровнями. Благодаря высокой интенсивности
света стало возможным наблюдение разл.
нелинейных процессов рассеяния света.
Особенно большую роль стало
играть вынужденное
рассеяние света, напр.
вынужденное комбинационное
рассеяние, Мандельштама
- Бриллюэна рассеяние и
др. Мн. процессы нелинейного рассеяния
объясняются чстырёхфотонными процессами.
Л. с., основанная на использовании
нелинейных процессов, часто наз. нелинейной
спектроскопией.Монохроматичность
лазерного излучения и избирательный
характер взаимодействия излучения с
частицами обеспечивают сильно выраженную
селективность возбуждения в вещество
определённых квантовых состояний
частиц, соответствующих резонансным
условиям их взаимодействия с полем
излучения. Изменение распределения
внутр. состояний поглощающей системы
под воздействием одного интенсивного
когерентногомонохроматич. излучения
влияет на её отклпк на поле др. излучения.
Этот метод исследования среды наз.
спектроскопией двойного резонанса. При
большой интенсивности падающего
излучения обеспечивается большая
плотность возбуждённых состояний в
веществе. Это дало возможность приступить
к широкомасштабному исследованию
физ.-хим. свойств возбуждённых частиц
и детальному изучению релаксационных
процессов (используя ультракороткие
импульсы возбуждающего лазерного
излучения) атомов и молекул. Когерентность
лазерного излучения применяется для
исследования разл. нестационарных
когерентных процессов в микроволновой
области.Фокусируя лазерное излучение,
можно производить спектральный анализ
микроколичеств вещества, локализованных
в малых (до 10-10 см 3)
объёмах. С помощью импульсов непрерывного
когерентного излучения исследуется
комбинационное и резонансное рассеяние
атомов и молекул, а также возбуждается
флуоресценция на больших расстояниях
от источника, что даёт возможность
дистанционного анализа атомного или
молекулярного состава исследуемого
объекта.
Основные
методы лазерной спектроскопии
Спектроскопия сверхвысокого разрешения
газов (спектроскопия бездоплеровского
уширения). Разрешающая
способность методов Л. с., как и обычных
методов, определяется шириной спектральных
линий.В газе при низких давлениях она
ограничена доплеровским уширением
линии, возникающим вследствие хаотич.
теплового движения атомов и молекул.
Нелинейные методы позволили устранить
влияние доплеровского уширения и
получать узкие линии с однородной
шириной на много порядков меньше
доплеровской ширины. Получены резонансные
линии шириной 
500
Гц, что соответствует относит. разрешающей
способности 5-Ю~12.
В основе нелинейной Л. с. сверхвысокого
разрешения лежат методы, к-рые позволяют
получать резонансы в центре линии: метод
насыщенного поглощения, метод двухфотонных
резонансов при поглощении и метод
разнесённых оптич. полей. Предельная
ширина резонанса ограничивается временем
взаимодействия частиц с полем, возможностью
обнаружения резонансов.С помощью
спектроскопии сверхвысокого разрешения
были наблюдены и исследованы эффект
отдачи в оптике (рис. 1), нелинейная
зависимость столкновительных уширении
спектральных линий и их сдвига, аномальный
эффект Зеемана на колебательно-вращательных
переходах, квадратичный эффект Доплера
и др. Сверхузкие резонансы используются
для постановки прецизионных физ.
экспериментов, на их основе создаются
оптич. стандарты частоты с относит.
нестабильностью 
10-14.
Новые возможности в Л. с. сверхвысокого
разрешения ожидаются при использовании
"холодных" частиц. Применение
"холодных" частиц позволяет
существенно увеличить время взаимодействия
частиц с полем и получить поэтому
предельно узкие резонансы. При этом
ослабляется влияние линейного и
квадратичного эффектов Доплера на сдвиг
и уширение резонансов.Спектроскопия
рассеяния света включает
широкий круг традиционных вопросов
спектроскопии рэлеев-ского (РР) и
комбинационного (КР) рассеяния света,
а также новых направлений нелинейной
спектроскопии рассеяния. Применение
лазеров существенно расширило возможности
спектроскопии рэлеевского рассеяния
прежде всего за счёт детального изучения
формы линия рассеяния на флуктуациях
плотности, темп-ры и пр., а также на
сфазированных лазерными пучками
неодно-родностях среды.Гетеродинные
методы исследования формы линий рассеяния
привели к разработке важного в практич.
отношении доплеровского метода измерения
скоростей потоков жидкостей и газов. В
спектроскопии КР была на неск. порядков
повышена чувствительность, что позволило
снимать спектры КР в газах низкого
давления, и заметно снижено мин. кол-во
вещества, необходимое для проведения
анализов. Наиб. важные направления
нелинейной спектроскопии рассеяния
света связаны с методами активной
лазерной спектроскопии КР,
напр. антистоксова и стоксова спектроскопии
вынужденного рассеяния Мандельштама
- Бриллюэ-на. Благодаря методам нелинейной
спектроскопии рассеяния была получена
информация, недоступная традиционным
методам. Напр., была развита спектроскопия
сверхвысокого разрешения КР в газах и
криогенных жидкостях, развиты методы
КР молекул, адсорбированных на поверхности,
и пр., существенно расширены возможности
оптич. исследований полупроводников и
кристаллов (рис. 2).Спектроскопия
пикосекундных импульсов использует
мощные импульсы света длительностью 
10-10-10-13 с
в сочетании с др. методами спектроскопии
(КР, насыщенного поглощения и пр.), что
позволяет исследовать очень быстрые
релаксационные процессы в конденсированных
средах. Осуществлены прямые измерения
времён жизни возбуждённых состояний в
конденсированных средах, определены
каналы распада энергии и передачи
возбуждения между разл. состояниями,
что особенно важно в биофизич. исследованиях
и при изучении динамики столкновения
частиц.
Воздействие мощного лазерного излучения на поверхность металлов и полупроводников приводит к ряду новых нелинейно-оптич. эффектов и соответственно к нелинейно-оптич. диагностике. В приповерхностных слоях металлов, полупроводников и диэлектриков возбуждаются сильно неравновесные состояния, резко возрастает оптич. восприимчивость среды. При отражении света от шероховатых поверхностей усиливаются такие нелинейно-оптич. взаимодействия, как генерация гармоник и суммарных частот. Измерены времена релаксации элементарных возбуждений в твёрдых телах (поляритонов, оптич. фононов и др.). Лазерное излучение может возбуждать на поверхностях акустич. волны (см. Поверхностные акустические волны), что лежит в основе нового направления - оптико-акустич. спектроскопии твёрдого тела.