Буферы для электрофореза

Почему мы используем именно такие вещества? Так исторически сложилось.

Основа почти у всех в качестве катионного компонента – Трисгидроксиметиламинометан.

Преимущества:

1. рКа 8.3, вблизи физиологического

2. дешев

3. достаточно велик

4. эффективный заряд при рН=рКа 0.5.

Недостаток:

Сильная зависимость рКа от температуры. Очень плохой буфер для ПЦР. Надо начинать с рН около 7, чтобы к 60º прийти к нужному рН.

Что касается анионных компонетов, тут был выбор, поскольку была эволюция.

Первые разработчики буферов, биологи, работали с белками. Их задачей было сохранить белки в целости, не инактивировать их. Следуя принципу алхимиков, подобное старались смешивать с подобным. Фосфат присутствует во всех биологических системах и ничем инородным не является. Соответственно, почему бы его не использовать. Ацетат – аналогично.

Потом пришли физхимики и сказали: это плохие компоненты. Например, фосфат всегда диссоциирован по первой ступени, буферность обеспечивает вторая, ее рКа как раз в районе физиологического рН. Но его эффективный заряд 1.5, а в квадрате все 2.25. И размер маловат. Примерно как у уксусной кислоты, а хотелось бы больше.

Ацетат имеет небольшой рН. И может использоваться только в качестве специфического буфера в кислой среде, а в диапазон 7-8 не работает никак (рКа=4.75)

Самым лучшим показалась борная кислота. Диссоциирует только по первой ступени, заряд 0.5, размер большой.

Сейчас Трис-Борат употребляется редко и в основном по-инерции (??????????)

Недостатки – более слабая, чем угольная, и еще и образует полибораты. Оставили на воздухе, СО₂ вытеснил борную, образовались полибораты – осадок и гетерогенная система, и гетерофазная. На посуде остается налет полиборатов, которые удаляются щелочью. Кроме того, взаимодействует с компонентами. Например, с нуклеиновыми кислотами, и даже с глицерином образует аддукты. Образует высоко полимерные комплексы, имитируя разделяемые биополимеры. Заряд у него отрицательный, каждая единица – минус. Дшинный аддукт с глицерином похож на двуцепочечную НК.

Фирма Омершан предложила буфер на основе сульфаминокислоты – таурина. Осадком не выпадает, с БП не взаимодействует. Размер еще больше, чем у бората. Правда, эффективный заряд великоват. Но аминогруппа компенсирует. И засчет того, что цвиттерион, рКа смещается ближе к 8 – достаточно эффективно поддерживает буферную емкость.

Можно использовать серин. Дешевый реагент, одобрено И.В. Морозовым. На опыте даже лучше таурина. Плюс еще любые ферменты в присутствии серина работают. Если выделяем из буфера, можем использовать как субстрат для любых реакций – нуклеинового обмена, обмена белков. То же самое, подобное в подобном.

С боратом такой номер не пройдет, он инактивирует большинство ферментов.

Катионный компонент:

(HOCH₂ )₃CNH₂ pKa 8.3 (20^oC)

∆ pKa / 10^oC -0.310

Анионные компоненты:

H₃PO₄ pKa₁ = 2.1, pKa₂ = 7.2, pKa₃ = 12.5 (18^oC)

CH₃COOH pKa = 4.75 (20^oC)

H₃BO₃ pKa ~ 8.5

H₂NCH₂CH₂SO₃H (Taurine) pKa₁ = 1.5, pKa₂ = 9.06 (25^oC)

HOCH₂CH(NH₂)COOH (Serine) pKa₁ = 9.21, pKa₂ = 2.20 (25^oC)

Проводимость растворов буферов

Буфер	Катион	Анион	pH	Проводимость mmhos/cm
TPE	50 mM TrisOH	H3PO4	7.0-7.5	1800
TAE, 2.5x	100 mM TrisOH	50 mM CH3COOH	7.5-8.0	3300
TAE	40 mM TrisOH	20 mM CH3COOH	7.5-8.0	1500
TBE	50 mM TrisOH	50 mM H3BO3	8.0-8.5	610
Tris:Taurine	89 mM TrisOH	28.5 mM Taurine	9.0	900
Tris:Serine	50 mM TrisOH	48 mM Serine	8.5	680

Но иногда даже ТРЕ нужен. Был эксперимент, смотрели скорость проникновения (быстрая кинетика) алкилирующих частиц в клетку и какие полимеры алкилирует. Реагент меченый, высоко активный, кинетика 20 с. А дальше непонятно, как такой эксперимент поставить. Инкубировали 20с, а дальше надо быстро зафиксировать, чтобы никаких реакций больше не происходило. Добавить ТХУ не пойдет, т.к. алкилирующий агент будет алкилировать даже в кислых рН. Значит, надо сразу БП разделить, и в том числе сразу отделить алкилирующий агент. Через 20 с нанести на э/ф и быстро включить ток. Алкилирующий агент сразу уйдет, у него подвижность очень высокая. Проблема – наносим на гель сразу очень много посторонних примесей, в т.ч. ионогенных. Это и среда, и взвесь клеток, и БП внутри цитоплазмы. Картина совершенно нерепрезентабельна. Очень большая перегрузка, большое количество ионогенных примесей. И никакие концентрации ТВЕ эту картину не улучшали. Взяли ТРЕ, только напряжение уменьшили после отделения алкилирующего агента. И все получилось, опубликовали. Это из-за большой проводимости.