Электрофорез в свободной среде

С помощью электрофореза мы можем определить соотношение заряд-размер.

Э/ф в св.ср мы не можем разделить НК, т.к. у них всех одинаковое соотношение заряд-размер. Разве что только ss от ds.

Проблемы – нам препятствуют диффузия и конвекция.

Диффузия – процесс более-менее контролируемый, применительно к большим молекулярным массам может быть неопасной. Однако диффузия с ростом молекулярной массы уменьшается на так уж быстро, пропорционально кубическому корню, а не 1-й степени! Диффузией крупных молекул в общем случае можно принебрьч, но на практике это утверждение не всегда выполняется.

А с конвекцией вообще сладу нет. При прохождении электрического тока выделяется тепло, возникает неравномерное распределение температуры по объему, и зоны быстро перемешаются, если мы уберем ток. Так что в зоне детекции мы скорее всего ничего не зарегистрируем технически. Так что потенциал использования сильно ограничен.

Есть решение – изотахофорез.

Изотахофорез

Решается проблема резкости границ, засчет того, в системе есть силы, которые поддерживают эти границы резкими. Одно время такая система широко использовалась.

Есть система молекул, различающихся по подвижности. Мы помещаем ее между электролитами, один (лидирующий) более подвижный по сравнению со всеми компонетами нашей системы, другой (замыкающий) – с очень маленькой подвижностью, меньше всех.. Для примера, возьмем случай разделения анионов, катионы у всех общие.

В электрическом поле сформируются зоны с резкими границами. И эти зоны будут до тех пор, пока приложено электричекое поле. Естественно, будут двигаться, в случае анионов от катода к аноду.

Почему? Доказательство от противного. Предположим, равновесие уже установилось. Границы уже резкие. Поскольку есть закон электоронейтроальности растворов и закон сохранения вещества, все границы будут двигаться с одинаковой скоростью. Поскольку подвижности у анионов разные, напряженность электрического поля внутри зон уже не одинакова.

(помним, что u = v / E)

Напряженность в зоне с малоподвижными ионами намного больше, чем в зоне более подвижных.

Можно сравнить с электрической цепью с последовательным соединением и вспомнить закон Ома.

Вдруг, один из ионов «отстал». Он попадает в зону с большей напряженностью, его скорость резко становится больше и он «выталкивается» в свою зону.

Каковы равновесные концентрации зон?

Систему изотахофореза можно использоватьне только для фракцинирования, но и для концентрирования.

Концентрация в зоне не зависит от исходной концентрации. И равновесная конфигурация не зависит от исходной конфигурации системы.

Для начала рассмотрим одну границу. Она движется с определенной скоростью. Анионы не пересекают эту границу. Катионы везде общие, движутся с разными скоростями.

Вариант 2. равенство тока в последовательной цепи.

Рассмотрим систему как проводник 2-го рода. У нас тогда последовательная цепь. По закону Ома ток в такой цепи одинаковый.

I₁ = I₂

Вспомним выражение из закона электронейтральности растворов:

I = S (uA CA ZA + uK CK ZK) = E S (u_A N_A + u_K N_K)

отсюда

(v + v^1K) C₁ = (v + v^2K) C₂ , член ES сокращен, т.к. он одинаков. V – одинакова для всех зон и границы.

Причем С1 и С2 определяют и катионы, и анионы.

C₂/C₁ = (v + v^1K) / (v + v^2K) = ......→1)

Дальше просто, 1 проблема – выразить Е₂ через Е₁ и подвижности.

C₂/C₁ = (u^A1+u^K) / (u^A1+ u^K u^A1 / u^A2) (1)

Вывод – соотношение концентраций определяются только подвижностями.

Вариант 1. (более сложный) Изменение концентрации на границе:

Начнем с постулата, что анионы не пересекают границу. Поток вещества через границу обусловлен только катионами. Поток это равен скорости границу умноить на концентрацию вещества, прошедшего через границу.

v^{границы} = v^A1 = u^A1E₁ = u^A2E₂ = v^A2 = v

E₂ = E₁ u^A1 / u^A2

v(C₁-C₂) = v^2KC₂ - v^1KC₁ - з-за того, что поток обусловлен только катионами

C₂(v + v^2K) = C₁(v + v^1K)

C₂/C₁ = (v + v^1K) / (v + v^2K) = (E₁ u^A1 + E₁ u^K) / (E₁ u^A1 + E₂ u^K)

Проверим выражение на «прочность» - рассмотрим предельные условия.

1. Все катионы зафиксированы. V^k= 0.

Получается проводник второго рода.

C2/C1 →1 ↔ C1 = C2 = Ci

Это логично. Скорости равны, напряженность обратно пропорциональна подвижности, значит разница в напряженности полностью обуславливается проводимостью (подвижностью) анионов, и концентрации просто обязаны быть равны, чтобы такая разница в напряженности имела место быть.

2. вся подвижность обусловлена катионами. u^K → ¥

C2/C1 → 1/uA1/uA2 = uA2/uA1 ↔ Ci ~ uAi

Это приводит к тому, что мы уже не можем регулировать напряженность, она реально не зависит от анионов.

Концентрация должна быть пропорциональна подвижности

Чтобы регулировать напряженность, регулируем концентрацию катионов.

Чтобы скорости зон оставались одинаковыми, в зоне с более высокой подвижностью анионов концентрация катионов должна быть маленькой, чтобы напряженность была маленькая.

Альтернативное рассмотрение предельных случаев:

( r – удельное (на единицу объема ) сопротивление )

uK → 0 - проводимость обусловлена анионами

• 1 / r ~ Ci * uAi Ei = I * ri ~ 1 / ( Ci * uAi )

• Ei * uAi = vграниц = const Þ 1 / Ci = 1 / Cj ↔ Ci = Cj

uK → ¥ - проводимость обусловлена катионами

• 1 / r ~ Ci * uK Ei = I * ri ~ 1 / ( Ci * uK )

• vграниц = Ei * uAi = uAi / ( Ci * uK ) = const Þ uAi / Ci = const ↔ Ci ~ uAi

На принципах изотахофореза работает DISC э/ф

Сейчас происходит «ренессанс» э/ф в свободной среде.

Например, капиллярный э/ф. Идея пришла из 60 годов. Разбиение общего объема на микрообъемы с подавлением переноса вещества между микрообъемами– способ борьбы с конвекцией.

Проблема – синхронизация процессов в разных капиллярах. Оставить только один капилляр не позволяла несовершенная система детекции.

Но как только появились чувствительные CD-камеры, люди вспомнили о капиллярном э/ф. Можно использовать такие объемы, в которых конвекцией можно просто пренебречь.

Пример использования э/ф в свободной среде. – получить чистые митохондрии.

Задача нетривиальная, т.к. надо получить именно функционирующие митохондрии.

Изящный выход. Пока функционируют, на мембране разность потенциалов засчет градиента протонов. Заряд связан с функционированием.

Есть макроскопический поток, тонкая трубка, в которой движется суспензия митохондрий, с определенной постоянной скоростью, перпендикулярно электрическому полю. В этом поле заряженные митохондрии отклоняются, нуклеиновые кислоты отклоняются в другую сторону, незаряженные органеллы движутся без отклонений. На выходе собираем, и получаем чистейшую фракцию митохондрий.

В идеале камеры для э/ф бесконечного объема.

От системы для э/ф нам нужна только напряженность. В идеале, хорошо бы, чтобы тока не было.

На электродах протекают побочные процессы – электролиз.

В реальных системах ток присутствует.

Мы должны уменьшить ток. Но уменьшать концентрацию фонового электролита – плохой вариант, т.к. тогда мы уменьшаем и максимальную концентрацию зон. Концентрация наших биополимеров должна быть пренебрежимо мала по сравнению с концентрацией фонового электролита.

Еще нам предстоит бороться с изменением рН.

Будем использовать такие электролиты, где реально происходит электролиз воды, т.е. где восстновительно-окислительные потенциалы катиона и аниона ниже чем, соответственно, протона или гидроксид-иона. Например, Na₂SO₄. Мы его, конечно, не будем использовать.

Итак, на электродах происходит электролиз воды:

анод: 4OH- - 4e- -> O₂ + 2H₂O pH ↓

катод: 4H+ + 4e- -> 2H₂ pH ↑

Следствие – небольшое уменьшение воды в системе, но оно так мало, что им можно пренебречь.

А вот измененение pH существенно, так как «разряжаются» протоны и гидроксидионы.

Например, ГЭФ в агарозном геле, а Трис-вцетатном буфере, в очень маленьком объеме. Если забыть выключить гель и уйти, да еще нанести бромфенол, то когда краситель дойдет до анода, то станет желтым, а гель весь скукожится. Трис-ацетат имеет небольшую буферную емкость, и деже за небольшой промежуток времени рН может упасть до 2.

«за постоянство рН нам предстоит бороться»

От тока зависит:

1. выделение тепла

2. интенсивность электролиза, ~I.

Какой фоновый эелектролит нам нужен? Рассмотрим выражение.

I = E S (u_AN_A + u_KN_K)

ES мы не будем трогать. А вот u подкорректировать можем.

П одвижность прямо пропорциональна заряду, обратно пропорциональна размеру.

А ток же пропорционален заряду в квадрате, и обратно пропорционален размеру.

Т.е., желательно брать большие молекулы.

Под размером имеется в виду эффективный размер (Li лучше Na).

Но гораздо более важно брать вещества, которые имеют небольшой заряд.

И еще нам важно буферная емкость. Она зависит от желаемого рН. Т.е. рКа электролита должно быть равно желаемому рН.

Важно помнить, что зависимость логарифмическая. При отклонении рКа от рН на 1, буферная емкость меняется на порядок!