История микроскопа
Идея создания оптического прибора, пригодного для исследования очень мелких и даже невидимых глазом объектов восходит к XIII-XVI вв. (Роджер Бэкон, Леонардо да Винчи, Джироламо Фракасторо). Первые инструменты подобного типа появились однако только к началу XVII в. в Италии и Голландии, мастера которых славились искусством изготовления очков. Вероятно, первый двухлинзовый оптический прибор был создан в Голландии Гансом и Захариасом Янссенами (1590). В 1610 г. Галилео Галилей, удлинив подзорную трубу, обнаружил, что она может увеличивать близко расположенные объекты. В 1624 г. он изготовил новый, усовершенствованный вариант своего инструмента, который отличался меньшими размерами и давал увеличение до 40 раз. С его помощью Стеллути исследовал органы пчелы (1625), а Чези спорангии папоротников (1628). Тогда же появился и термин “микроскоп”, которым стали обозначать сконструированный Галилеем инструмент в противоположность телескопу (Фабер, 1625).
В 1611 г. Иоганн Кеплер предложил схему короткотубусного микроскопа, состоящую из двух выпуклых линз, которая и стала в дальнейшем использоваться в микроскопии. В Англии кеплеровский микроскоп появился в 1619 г. благодаря придворному мастеру Корнелиусу Дреббелю. Позднее изготовленные Дреббелем микроскопы стали известны не только в Англии, но и в континентальной Европе. Растительная клетка была открыта Робертом Гуком с помощью одного из микроскопов Дреббеля (1665). Однако Гук внес в него усовершенствования, поместив между объективом и окуляром линзу для расширения поля зрения, а между источником света и объективом линзу для концентрирования света (коллектор).
Создающие более ровное поле зрения двухлинзовые окуляры, были впервые предложены итальянцем Дивини (1667), а объективы из двух линз (дублеты) – немецким оптиком Штурмом (1672). Плоское зеркало, позволявшее освещать объект дневным светом, было введено в микроскоп Гертелем в 1716 г. К середине XVIII в. в Англии микроскопы изготавливали уже несколько мастеров Калпепер, Скарлет, Стьюарт и Кафф, а в конце этого века были популярны микроскопы Адамса, конструкция которых во многом напоминала современные приборы. Однако присущие оптике этих микроскопов хроматическая и сферическая аберрации не позволяли проводить исследования на большом увеличении. Вероятно поэтому многие микроскописты XVII и XVIII вв. все еще пользовались лупами (Сваммердам, Левенгук, Либеркюн и др.).
Хотя еще в 1771 г. петербургский академик Леонард Эйлер разработал математическую теорию, позволявшую устранить хроматическую аберрацию в микроскопе, первые объективы-ахроматы были изготовлены только в начале XIX в. (Билдснейдер, ван Дейл, Фраунгофер, Шевалье). С 30 гг. XIX в. в Европе появляется несколько фирм, производящих удобные в работе и недорогие ахроматические микроскопы. В частности, автор клеточной теории Теодор Шванн использовал микроскоп фирмы Шик (Берлин), а основатель гистологии Ян Пуркине работал с микроскопом фирмы Плессль (Вена). Микроскопировались только свежие образцы тканей, поскольку методы фиксации и окраски еще не были известны. Срезы растений получали с помощью бритвы, у животных исследовали тонкие пленки и раздавленные или расщипанные кусочки тканей. Заметным событием в истории микроскопии было изобретение водной иммерсии Амичи (1850), что позволило повысить разрешение микроскопа на больших увеличениях.
В 1846 г. в Иене (Германия) начала свою деятельность фирма Карл Цейсс, создавшая к концу XIX в. классическую конструкцию светового микроскопа под руководством профессора Эрнста Аббе (1840-1905). Используя разработанную Френелем, Фраунгофером и Рэлеем диффракционную теорию света, Аббе сформулировал математическую теорию микроскопа, что поставило конструирование этих приборов на научную основу.
В 1872 г. Аббе предложил конструкцию универсального осветительного устройства, пригодного для работы с различными объективами, которое под названием “конденсор Аббе” до сих пор используется в микроскопах. Крупным достижением Аббе было также введение масляных иммерсий, что позволило значительно увеличить светосилу объективов (1878). В 1886 г. фирма Цейсс выпустила рассчитанные Аббе объективы-апохроматы с полностью исправленной хроматической аберрацией, которые достигли предела разрешения светового микроскопа (200-250 нм).
Паралелльно усовершенствованию микроскопа развивались и методы подготовки препаратов, причем исследование свежего материала вытеснялось изучением окрашенных срезов фиксированных тканей. В качестве фиксаторов использовали кислоты, спирты, соли тяжелых металлов и их смеси в различных сочетаниях. Например, одним из наиболее употребительных цитологических фиксаторов была жидкость Флемминга, состоящая из смеси хромовой, осмиевой и уксусной кислот. Формалин в качестве фиксатора впервые стал использовать Блюм в 1893 г.
Хотя некоторые фиксаторы и обеспечивали уплотнение животных тканей, достаточное для изготовления срезов бритвой, более тонкие срезы можно было получить только с помощью специального устройства микротома (изобретен учеником Пуркине Ошатцем в 1844 г.) после предварительного обезвоживания материала и заливки его в парафин. Для окраски препаратов с середины XIX в. использовали природные красители кармин и гематоксилин, а с 70-80 гг. к ним добавились синтетические красители на основе анилина индигокармин, эозин, кислый фуксин, сафранин и др.
С прогрессом микроскопии были тесно связаны многочисленные научные достижения цитологии конца XIX в. Крупнейшими из них являлись описания митоза (Флемминг, Рабль), оплодотворения и мейоза (Гертвиг, Фоль, Бенеден, Бовери, Страсбургер, Навашин). В это же время были открыты такие цитоплазматические органеллы как центросомы (Бенеден, 1876; Гейденгайн, 1891), митохондрии (Альтманн, 1890; Бенда, 1898) и пластинчатый комплекс (Гольджи, 1898).
Основным приемом микроскопирования с самого начала появления микроскопа и до сих пор является метод светлого поля, при котором клетки изучают в проходящем свете. Однако, еще в 1837 г. Рид предложил метод темного поля, обладавший повышенным разрешением. Первый поляризационный микроскоп, позволяющий исследовать анизотропные структуры, был разработан в 1882 г. фон Эбнером. Флуоресцентная микроскопия, которая в наше время получила широкое распространение в сочетании с иммуноцитохимией, развилась благодаря работам Келера, Зидентопфа и Лемана (1904-1913). В 1936 г. шведский ученый Касперссон объединил в одну конструкцию микроскоп и спектрофотометр, что позволило исследовать спектры поглощения микроструктур и определять количество ДНК в одной клетке. С помощью этого прибора, который получил название микроспектрофотометр (цитофотометр), было показано постоянство содержания ДНК в соматических клетках и обнаружено ее удвоение перед делением (Свифт, 1950).
Разработанная Аббе теория микроскопа предсказывала, что использование волновых свойств электрона может обеспечить формирование изображений микроструктур размером менее 1 нм. Первый электронный микроскоп был построен в Высшей технической школе в Берлине в 1929-1931 гг. под руководством Кнолля, а изображение клетки в нем впервые получил фон Арденне в 1945 г. Во второй половине XX в. электронная микроскопия позволила исследовать тонкую структуру известных ранее клеточных компонентов, а также обнаружить ряд новых гладкую и шероховатую плазматическую сеть, рибосомы, лизосомы, опушенные везикулы, секреторные гранулы, включения (Шестранд, Паладе, Сикевиц, де Дюв и др.).
Серьезным недостатком наиболее распространенных методов световой и электронной микроскопии является то, что они позволяют исследовать только фиксированные и окрашенные клетки. Однако из диффракционной теории известно, что прошедшая через нефиксированную и неокрашенную живую клетку световая волна содержит тоже информацию, которая закодирована в сдвигах волнового фронта. В 1934 г. немецкий оптик Цернике разработал метод фазового контраста, позволивший перевести эти сдвиги в различия интенсивности света и тем самым сделать их наблюдаемыми (Нобелевская премия по физике 1953 г.). В настоящее время усовершенствованный вариант этого метода дифференциальный интерференционный контраст (DIC) широко используется для наблюдений за живыми клетками.
Крупным событием в цитологии XX в. было изобретение конфокального микроскопа, позволяющего создавать трехмерные реконструкции клеток. Принцип конфокальной микроскопии был запатентован Марвином Мински в 1957 г., а первый прибор был изготовлен фирмой Био-Рад для изучения ориентации митотичеких фигур при дроблении в 1989 г. В настоящее время конфокальные микроскопы выпускают все ведущие фирмы Цейсс, Олимпус, Никон, Лейка и др.
Успехи молекулярной и клеточной биологии, а также прогресс электроники, оптики и компьютерной техники стимулировали в конце XX в. разработку принципиально новых методов микроскопии, позволивших преодолеть диффракционный предел Аббе и получить разрешение в световом микроскопе, сопоставимое с разрешеним электронного микроскопа.