Лабораторная работа №3

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Цель работы – закрепить знания по аминокислотному составу белков и приобрести навыки проведения цветных реакций на белки и отдельные аминокислоты.

При взаимодействии белка с отдельными химическими веществами возникают окрашенные продукты реакции. Образование их обусловлено присутствием в молекуле белка той или иной аминокислоты, имеющей в боковом радикале определенную химическую группировку. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, содержащим те же химические группировки, поэтому для установления наличия белка недостаточно проведения одной какой-нибудь реакции.

Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность установить белковую природу вещества и доказать присутствие некоторых аминокислот в различных природных белках. На основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот.

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови, 1% раствор яичного белка (белок одного куриного яйца растворяют в 20-кратном объеме дистиллированной воды, фильтруют через марлю).

Реактивы:

1. 10% раствор NaOH.

2. 1% раствор CuSO₄.

3. 0,1% водный раствор нингидрина.

4. Концентрированная азотная кислота.

5. Ледяная уксусная кислота.

6. Концентрированная серная кислота.

7. 5% раствор ацетата свинца.

Оборудование:

1. Штатив с пробирками.

2. Пипетки.

3. Песчаная баня или спиртовка.

Ход работы:

1. Биуретовая реакция на пептидную группу

Метод основан на способности пептидных групп образовывать в щелочной среде с ионами Cu²⁺ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке. В сильно щелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионом Cu²⁺, образуя окрашенный биуретовый комплекс. Ковалентные связи этого комплекса образованы за счет енольного гидроксила, а координационные – за счет атомов азота амино- и иминогрупп, имеющих неподеленные электронные пары:

В пробирку вносят 5 капель исследуемого раствора и прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора CuSO₄, в результате в пробирке появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Биуретовая реакция положительна с пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. С ди- и трипептидами она неустойчива. Кроме белков биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных групп, например, биурет H₂N-CO-NH-CO-N₂H.

На основании биуретовой реакции разработаны методы количественного определения белков.

2. Нингидриновая реакция на α-аминогруппу

Метод основан на взаимодействии нингидрина с α-аминогруппой аминокислот, пептидов, белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета. В этой реакции α-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию, декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО₂. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет. Химизм нингидриновой реакции:

α-аминокислота нингидрин альдегид восстановленный нингидрин

продукт конденсации

К 5 каплям исследуемого раствора приливают 5 капель 0,1% водного раствора нингидрина, нагревают до кипения и через 1-3 мин наблюдают появление окрашивания.

Нингидриновая реакция может быть положительна с некоторыми аминами и амидами кислот.

Нингидриновая реакция может быть использована для количественного определения α-аминокислот.