Методи виділення та ідентифікації амінокислот
Фракціонування і визначення окремих амінокислот. Деякі амінокислоти дають кольорові реакції або володіють характерним спектром поглинання, що створює можливість їх кількісного визначення. Існують, проте, і більш загальні методи, що дозволяють ідентифікувати, а потім і визначити вміст кожної з амінокислот в суміші після фракціонування. Ці методи можуть бути використані при дослідженні тканинних екстрактів, біологічних рідин (плазми крові, сечі) або білкових гідролізатів, в яких зв'язок між амінокислотами вже розірваний.
Хроматографія на папері (Мартін, Гордон і Синдж). Цей метод відіграє важливу роль при аналізі амінокислот, і сама техніка хроматографії на папері була розроблена саме для цієї мети.
Коли мають справу з складною сумішшю амінокислот, наприклад при аналізі гідролізата білків, доводиться вдаватися до двомірної хроматографії. При проведені хроматографії в одному напрямі часто використовують як розчинник фенол, а в перпендикулярному – суміш бутанола і водного розчину оцтової кислоти. Амінокислоти проявляють за допомогою нінгідрина при підвищеній температурі. Амінокислоти, які відносяться до однієї групи, розташовуються на одній плавній кривій.
Іонообмінна хроматографія на колонці (Мур і Стейн). Цей метод дозволяє проводити кількісне визначення амінокислот у суміші. Скляну колонку заповнюють смолою, яка містить на матриці полістиролу угрупування – SO3H-Na+. В кислому середовищі амінокислоти поводять себе як основи. Вони утворюють катіони, здатні витісняти частину іонів Na+ і, займаючи їх місце, затримуватися на колонці. Чим більш основною є дана амінокислота, тим міцніше вона зв'язується електростатичними силами із смолою. Потім через колонку пропускають елюючу рідину, поступово збільшуючи її рН (градієнт рН). Коли рН елюента наближається до значення рН, відповідного даній амінокислоті, вона відділяється від смоли і починає рухатися уздовж колонки. Оскільки величини pHi для різних амінокислот неоднакові, амінокислоти виходять з колонки по черзі. Необхідно, проте, мати на увазі, що міцність зв'язку між амінокислотою і смолою обумовлена не тільки електростатичними силами, а залежить також від сил іншої природи. Тому в деяких випадках порядок виходу амінокислот може не відповідати порядку зміни величини рНi. Процес проведення хроматографії залежить від температури. Методика колоночної хроматографії використовується в двох варіантах:
а) в поєднанні з колектором фракцій. Амінокислоти збирають в окремі пробірки у вигляді невеликих фракцій. В кожну з пробірок додають нінгідрин і нагрівають (реакцію з нінгідрином проводять зазвичай при підвищеній температурі). За допомогою спектрофотометра вимірюють потім спектри поглинання кожної з фракцій і, виходячи з отриманих даних, обчислюють концентрацію кожної амінокислоти. Таким чином одержують серію кривих, що відповідають послідовному виходу амінокислот. Природу кожної амінокислоти встановлюють за об'ємом елюента, що витрачається на зняття цієї амінокислоти із смоли, з урахуванням заздалегідь проведених калібрувальних дослідів;
б) з автоматичним аналізатором, що працює за таким принципом. Рідина, що витікає з колонки, за допомогою насоса змішується з нінгідрином. Суміш проходить спочатку через водяну баню, де підігрівається, а потім через кювету спектрофотометра, який безперервно реєструє поглинання світла при 570 нм (фіолетове забарвлення нінгідрииа зі всіма амінокислотами) і при 440 нм (жовте забарвлення проліна з нінгідрином). Дані спектрофотометра реєструються на стрічці, що рухається, або на листі паперу. Площа, яка обмежена кривою і базовою лінією, пропорційна концентрації відповідної амінокислоти.
Електрофорез. Завдяки своєму електричному заряду амінокислоти можуть переміщуватися в електричному полі (рис. 1). Проте через малий розмір молекул вони легко дифундують і тому їх розділення можливе тільки при використанні твердої основи, наприклад паперу або крохмалю. Розділення йде по групах. Так, наприклад, при рН 4,0 дикарбонові амінокислоти ще залишаються кислотами і аніонами. Вони прямують до позитивного полюса – аноду. Нейтральні ж і лужні амінокислоти рухаються в цих умовах до негативного полюса – катоду, оскільки при рН 4,0 вони несуть позитивний заряд.
Рис. 1. Прилад для проведення електрофорезу (а), електрофореграма (b).