22. Гибридизация in situ, зонды. Соузерн-, Нозерн- и Вестерн-блотинг.

Флюорисцентная гибридизация in situ – это метод, кот позволяет выявить хромосомные аномалии. In situ озн-ет нечто, нах-ся в его естественном или первоначальном состоянии, т.е. этот метод дает возможность исследовать гены в их природном положении. В этом методе для выявления конкретной хромосомной аномалии исп-ют особое хим. в-во, кот явл. меткой или зондом. Препараты фиксированных хромосом гибридизуют (инкубируют при повышен. температуре с последующим охлаждением) с исследуемыми пос-ми нуклеотидов, меченными радиоактивной, флюорисцентной или иной меткой. После отмывания не связавшейся метки оставшиеся меченые мол нукл кис-т оказываются ассоциированными с уч-ми хромосом, содержащими посл-ти, комплиментарные исследуемым меченным послед-ям нуклеотидов. Полученные гибриды анализируют с пом микроскопа либо непосредственно, либо после авторадиографии. Для этой гр методов харак-на более высокая разрешающая спосо-ть, чем для гибридизации соматич. кл-ми, т.к. они позв-ют локализовать изучаемые послед-ти нуклеотидов на хромосомах. В этом типе гибридизации могут применяться зонды 3 разл. типов:1. локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными уч-ми хромосом. Данные зонды исп-ся для идентификации имеющейся короткой посл-ти выделенной ДНК, кот исп-ся для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом. 2. альфоидные, или центромерные зонды-повторы. Предст-ют собой повторяющиеся посл-ти центоромерных областей хромосом. С их пом каждая хромосома может быть окрашенв в разл цвет, что позв-ет быстро определить число хромосом и отклонение от нормального их числа. 3. зонды на всю хромосому. Явл набором небольших зондов, комплиментарных к отдельным уч-ам хромосом, но в целом покрывающими всю ее длину. Применяется для анализа хромосомных аберраций,например, транслокации, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо др. Блоттинг (промакиванием) - методики, включающие этап переноса разделенных макромол из определен. Среды, н-р геля, на какой либо носитель (спец бумага, нитроцеллюлозные фильтры и тп). Сущ-ет 2 основных типа блоттинга: капиллярный (н-р, Соузерн-блоттинг), в основе кот-го лежит перемещение мол благодаря капиллярному эффекту, и электроблоттинг, при кот-м перенос мол обеспеч-ся путем электрофареза. В исследованиях генома чел для выявления опред.посл-ти ДНК в образце часто исп-ют метод блотинга, разработанный Саузерном. Он сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделенной по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. Радиоактивно меченные уч-ки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДнК. Метод исп-ют для выявления крупных перестроек в ДнК и некоторых точечных мутаций. Значим-ть метода для медицины обусловлена возможностью исследовать определен. фрагмент геномной ДНК у любого чел. Др.технологии переноса, н-р, вестерн-, нозерн-блоттинг исп-т сходные методы, но для определения РНК или белка в образце, и наз-ся по образцу метода, придуманного Саузерном. Нозерн- блоттинг – метод выявления РНК. Вестерн-блоттинг – метод выявления некоторых белков. После их отделения с пом электр-за, белки соедин-ся с меченными радиоактивным вещ-вом антителами и идентифицируются при рентгенологическом исследовании. Нозерн- блоттинг – метод выявления РНК.

23. Методы секвинирования ДНК. Секвенирование биополимеров – определение их АК или нуклеотидной послед-ти. В рез-те получ-ся линейное символьное описание, кот. сжато резюмирует атомную структуру молекулы. Методы: 1.Метод Максама и Гилберта (химический).Основан на хим. расщеплении ДНК. Один из концов фрагмента ДНК метят с пом. изотопа фосфора³²p. В последнее время вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую метку. Ее можно цеплять и к нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску: А и Ц метилируются диметилсульфатом, пиримидиновые основания модифицируются гидразином. Препарат меченой ДНК делят на 4 порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно из 4 оснований, причем условия р-ии подбираются таким образом, чтобы на каждую мол. ДНК приходилось лишь несколько повреждений. В результате получ-ся набор меченных фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца мол. Фрагменты, кот содержат радиоактивную метку, оставляют отпечатки на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченного конца нах-ся разрушенное основание, а зная это основание – его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность. Флюорисцентное окрашивание: если на каждого из 4 нуклеотидов был подобран свой цвет флюорисцентной метки, то при электрофорезе их наносят на одну дорожку, тогда расположение нуклеотидов отменно штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать. 2. Метод Сенгера (ферментативный). Сенгер исп-л ДНК-полимеразу1. В Кл этот Ф уч-ет в процессе репликации, заполняя пробелы м-у вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы Ф в пробирке треб-ся предшественники ДНК – дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, а также одноцепочечная матрица, на кот должен быть небольшой двухцепочечный уч-ок – затравка, с кот нач-ся синтез. Были также синтезир-ны модифиц-ые дидезоксирибонуклеотиды, в кот дезоксирибоза 3-ОН отсутствует для каждого из 4 оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифиц-ое основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В рез-те рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включ-ся дидезоксирибонуклеотид. Поэтому их наз-ют терминаторами элонгации. Рекционная смесь по Сенгеру сос-ит из цепи ДНК, комплиментарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из 4 дидезоксирибонуклеотида и соответствующего дезоксирибонуклеотидтрифосфата в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Готовят 4 смеси, каждая из которых сод-т 1 из 4 дидезокирибонуклеотидов. В каждой из пробирок обр-ся набор меченных фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченные фрагменты ДНК разделяют в геле, проводят радиоавтография и по картине распределения фрагментов в 4 пробах устанав-ют нуклеотидную посл-ть ДНК.