Національний університет біоресурсів і природокористування України

Реферат

На тему : «СПЕЦІАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ. БІОТЕХНОЛОГІЯ ПРОМИСЛОВОГО КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ – ПРОДУЦЕНТІВ»

Студентки ФВМ

2 курсу 4 групи

Нікандрової Орини

Київ - 2012

Зміст

1. Параметри культивування.

2. Схема ферментації.

3. Види культивування: поверхневе, глибинне; періодичне,

безперервне, періодичне з додаванням субстрату, система

безперервного культивування поршневого типу; аеробне;

анаеробне; стерильне; нестерильне.

4. Біореактор.

5. Джерела

1. Параметри культивування

Культивування є основною стадією технологічного процесу мікробного синтезу (рис.34). Воно визначає кількісні та якісні характеристики виробництва біопрепаратів.

Під час культивування отримують:

1. біомасу

2. продукти метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у

культуральній рідині.

Науковці вважали, що перехід від лабораторного синтезу до промислового це питання звичайного збільшення масштабу – треба більший реактор та більшу кількість середовища. Нажаль, це не відповідає дійсності. Наприклад, якщо взяти аеробні мікроорганізми, які добре ростуть у звичайній колбі на 200 мл при аерації змішувачем потужністю 300 Вт і збільшити об’єм колби до 10000 л, тоді необхідно буде взяти змішувач потужністю 15 МВт. Його двигун буде розміром з будинок, а під час перемішування виділиться стільки тепла, що мікроорганізми просто зваряться.

Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.

Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.

Культивування вимагає оптимізації таких параметрів:

• Температура (інтервал робочих Т коливається 25-60оС);

• рН ( від 2до 9, з точністю до 0,2 рН);

• спосіб перемішування;

• концентрацію кисню для аеробів (розхід повітря від 0,15-до

2,5 м3/ м3середовища /хв);

• стерильність;

• запобігання розповсюдженню мікроорганізмів-продуцентів у

зовнішне середовище;

• Час культивування (для отримання біомаси -24 год,

первинних метаболітів – 48-72 год, вторинних 72-144год).

Як правило оптимальні умови культивування змінюються при

кожному десятикратному збільшенні об’єму біореактору.

2. Промислова ферментація процес багатоступеневий:

1. Процедура розпочинається з виготовлення та стерилізації

культурального середовища та обладнання.

2. Спочатку вирощують висхідну культуру (5-10 мл)

3.Потім інкубують її у колбі, яку струшують (200-1000мл)

4. Після цього її переносять у ферментер для посівного

матеріалу (10-100л)

5.Потім у промисловий ферментер (1000-100000 л)

6.Збір матеріалу

7.Якщо продукт локалізований всередині клітини, останні

руйнують та видаляють

8.Якщо продукт секретується, його виділяють безпосередньо з

середовища.

3.Промислове культивування мікроорганізмів

Розрізняють:

• Поверхневе - вирощування промислової культури на середовищі, яке містить тверді частки субстрату:

• Твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні щільного середовища.

• Рідке – ростуть на поверхні рідкого поживного середовища

• Глибинне – розподіляються у всьому об’ємі, а компоненти поживного середовища надходять в результаті аерації та перемішування.

• Періодичне – мікроорганізми вирощують у стерильних умовах без додавання свіжого культурального середовища

• Безперервне – свіже культуральне середовище надходить у ферментер безперервно, паралельно відводиться така сама кількість клітинної суспензії.

• Періодичне з додаванням субстрату – до культури періодично додають поживні речовини, а культуральне середовище не видаляють до кінця культивування

• Аеробне

• Анаеробне

• Стерильне

• Нестерильне

Поверхневе культивування – відбувається у кюветах, які виготовлені з оцинкованої жесті або нержавіючої сталі з перфорованим дном. Заповнені поживним середовищем кювети розміщують на етажерках з невеликим нахилом. Кювети об’єднують у касети. Цей спосіб не є ефективним і використовується у разі відсутності альтернативного способу культивування. Використовується для отримання деяких ферментів з грибів-продуцентів, які культивуються на нестандартній сировині – відходах. Пшеничні висівки для отримання протеаз і амілаз, солодові паростки – вітаміни та амінокислоти.

Глибинне культивування - більш ефективний вид ферментації, дозволяє виробляти на одиницю часу та об’єму більшу кількість цільового продукту.

Періодичне культивування залежить від кінетичної кривої росту мікроорганізмів:

1.Лаг-фаза – клітини адаптуються до нових умов (рН, концентрація поживних речовин). Ця фаза спостерігається кожен раз, якщо посівний матеріал отриманий з культури у стаціонарну фазу. Тривалість лаг-фази залежить від часу знаходження у стаціонарній фазі і від відмінностей попереднього і нового середовища. Якщо посівний матеріал отриманий від культури у експоненціальну фазу – ріст почнеться зразу без вираженої лаг-фази.

2.Експоненціальна фаза характеризується діленням клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною. В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється і культура переходить у стаціонарну фазу.

3.Стаціонарна фаза. Біомаса залишається постійною, метаболізм змінюється. В цей період синтезуються вторинні метаболіти.

4.Фаза відмирання – енергетичні запаси закінчуються, метаболізм припиняється. Ферментацію зупиняють у стаціонарну фазу.

Періодична культура з додаванням субстрату.

У ферментер періодично додають субстрат, а кінцевий продукт збирають лише по завершенню культивування. Додавання субстрату призводить до подовження експоненціальної та стаціонарної фаз, а також до збільшення біомаси та кількості метаболітів. У стаціонарну фазу мікроорганізми синтезують протеолітичні ферменти, які руйнують усі білки. Тому, якщо метою культивування є отримання білкових продуктів, треба зупинити ферментацію до цієї фази. В залежності від генотипу мікроорганізмів та природи рекомбінантного білка під час періодичної ферментації з додаванням субстрату вихід продукту може зрости на 25-1000% у порівнянні з простою періодичною ферментацією. Періодичне культивування з додаванням субстрату можна використовувати для культивування клітин тварин та комах.

Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами – видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок поділу. Широке розповсюдження набули системи:

Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища, у якому знаходяться мікроорганізми Це процес, при якому у культуру з постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище, а об’єм культури підтримується на постійному рівні шляхом безперервного видалення частини культуральної рідини. Базується на твердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить від поживних речовин, які знаходяться у середовищі і лише від субстрату, якій лімітує ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні компоненти були у надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні для синтезу клітини у необхідній концентрації. Цейєдиний компонент, якого не стає лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у сталому стані.

Турбидостат – це культивування де постійна концентрація мікроорганізмів підтримується шляхом регулювання оптичної щільності культури. У разі перевищення встановленого рівня вмикається насос, якій подає свіже середовище.

Система безперервного культивування поршневого типу – дозволяє імітувати періодичне культивування. Використовується лише у лабораторних умовах.

Стерильне та нестерильне культивування.

Ідеальний варіант припускає 100% домінування виробничої культури. Однак, на практиці ця умова не виконується. Реально вдається забезпечити переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це має значення на початку ферментації. У подальшому з’являється стороння мікрофлора і завдання біотехнолога створити умови культивування, які б пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі умови, які забезпечують домінування виробничого штаму над сторонньою мікрофлорою.

Приклад - культивування у безперервних умовах кормових дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких рН, отримання кормового вітаміну В12 та анаеробне бродіння органічних речовин з використанням термофільних мікроорганізмів в температурних умовах 50-55оС. також можна збільшити частку посівного матеріалу до 20-25%.

Аеробне та анаеробне культивування.

Під час аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню у середовищі. Це досягається шляхом забезпечення необхідної концентрації розчиненого кисню у рідкому середовищі, шляхом надходження кисню по трубах (барботерах) з малими отворами по всій довжині. При цьому кисень надходить у середовище у вигляді дрібних пухирців, які розчиняються під дією мішалки. Інколи використовують анаеробне культивування, наприклад для отримання вітаміну В12