Національний університет біоресурсів і природокористування України
Реферат
На тему : «СПЕЦІАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ. БІОТЕХНОЛОГІЯ ПРОМИСЛОВОГО КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ – ПРОДУЦЕНТІВ»
Студентки ФВМ
2 курсу 4 групи
Нікандрової Орини
Київ - 2012
Зміст
1. Параметри культивування.
2. Схема ферментації.
3. Види культивування: поверхневе, глибинне; періодичне,
безперервне, періодичне з додаванням субстрату, система
безперервного культивування поршневого типу; аеробне;
анаеробне; стерильне; нестерильне.
4. Біореактор.
5. Джерела
1. Параметри культивування
Культивування є основною стадією технологічного процесу мікробного синтезу (рис.34). Воно визначає кількісні та якісні характеристики виробництва біопрепаратів.
Під час культивування отримують:
1. біомасу
2. продукти метаболізму, які накопичуються у середині клітини та у
культуральній рідині.
Науковці вважали, що перехід від лабораторного синтезу до промислового це питання звичайного збільшення масштабу – треба більший реактор та більшу кількість середовища. Нажаль, це не відповідає дійсності. Наприклад, якщо взяти аеробні мікроорганізми, які добре ростуть у звичайній колбі на 200 мл при аерації змішувачем потужністю 300 Вт і збільшити об’єм колби до 10000 л, тоді необхідно буде взяти змішувач потужністю 15 МВт. Його двигун буде розміром з будинок, а під час перемішування виділиться стільки тепла, що мікроорганізми просто зваряться.
Ферментація – сукупність послідовних операцій від внесення у підготовлене середовище посівного матеріалу і до завершення процесу росту клітин або біосинтезу цільового продукта.
Культуральна рідина - складна суміш, яка утворюється після закінчення ферментації і складається з клітин продуценту, розчину невикористаних поживних компонентів і продуктів біосинтезу.
Культивування вимагає оптимізації таких параметрів:
• Температура (інтервал робочих Т коливається 25-60оС);
• рН ( від 2до 9, з точністю до 0,2 рН);
• спосіб перемішування;
• концентрацію кисню для аеробів (розхід повітря від 0,15-до
2,5 м3/ м3середовища /хв);
• стерильність;
• запобігання розповсюдженню мікроорганізмів-продуцентів у
зовнішне середовище;
• Час культивування (для отримання біомаси -24 год,
первинних метаболітів – 48-72 год, вторинних 72-144год).
Як правило оптимальні умови культивування змінюються при
кожному десятикратному збільшенні об’єму біореактору.
2. Промислова ферментація процес багатоступеневий:
1. Процедура розпочинається з виготовлення та стерилізації
культурального середовища та обладнання.
2. Спочатку вирощують висхідну культуру (5-10 мл)
3.Потім інкубують її у колбі, яку струшують (200-1000мл)
4. Після цього її переносять у ферментер для посівного
матеріалу (10-100л)
5.Потім у промисловий ферментер (1000-100000 л)
6.Збір матеріалу
7.Якщо продукт локалізований всередині клітини, останні
руйнують та видаляють
8.Якщо продукт секретується, його виділяють безпосередньо з
середовища.
3.Промислове культивування мікроорганізмів
Розрізняють:
Поверхневе - вирощування промислової культури на середовищі, яке містить тверді частки субстрату:
Твердофазне – мікроорганізми ростуть на поверхні щільного середовища.
Рідке – ростуть на поверхні рідкого поживного середовища
Глибинне – розподіляються у всьому об’ємі, а компоненти поживного середовища надходять в результаті аерації та перемішування.
Періодичне – мікроорганізми вирощують у стерильних умовах без додавання свіжого культурального середовища
Безперервне – свіже культуральне середовище надходить у ферментер безперервно, паралельно відводиться така сама кількість клітинної суспензії.
Періодичне з додаванням субстрату – до культури періодично додають поживні речовини, а культуральне середовище не видаляють до кінця культивування
Аеробне
Анаеробне
Стерильне
Нестерильне
Поверхневе культивування – відбувається у кюветах, які виготовлені з оцинкованої жесті або нержавіючої сталі з перфорованим дном. Заповнені поживним середовищем кювети розміщують на етажерках з невеликим нахилом. Кювети об’єднують у касети. Цей спосіб не є ефективним і використовується у разі відсутності альтернативного способу культивування. Використовується для отримання деяких ферментів з грибів-продуцентів, які культивуються на нестандартній сировині – відходах. Пшеничні висівки для отримання протеаз і амілаз, солодові паростки – вітаміни та амінокислоти.
Глибинне культивування - більш ефективний вид ферментації, дозволяє виробляти на одиницю часу та об’єму більшу кількість цільового продукту.
Періодичне культивування залежить від кінетичної кривої росту мікроорганізмів:
1.Лаг-фаза – клітини адаптуються до нових умов (рН, концентрація поживних речовин). Ця фаза спостерігається кожен раз, якщо посівний матеріал отриманий з культури у стаціонарну фазу. Тривалість лаг-фази залежить від часу знаходження у стаціонарній фазі і від відмінностей попереднього і нового середовища. Якщо посівний матеріал отриманий від культури у експоненціальну фазу – ріст почнеться зразу без вираженої лаг-фази.
2.Експоненціальна фаза характеризується діленням клітин, при цьому питома швидкість росту залишається постійною. В результаті виснаження лімітуючого субстрату або накопичення продуктів метаболізму, які пригнічують ріст, збільшення клітин припиняється і культура переходить у стаціонарну фазу.
3.Стаціонарна фаза. Біомаса залишається постійною, метаболізм змінюється. В цей період синтезуються вторинні метаболіти.
4.Фаза відмирання – енергетичні запаси закінчуються, метаболізм припиняється. Ферментацію зупиняють у стаціонарну фазу.
Періодична культура з додаванням субстрату.
У ферментер періодично додають субстрат, а кінцевий продукт збирають лише по завершенню культивування. Додавання субстрату призводить до подовження експоненціальної та стаціонарної фаз, а також до збільшення біомаси та кількості метаболітів. У стаціонарну фазу мікроорганізми синтезують протеолітичні ферменти, які руйнують усі білки. Тому, якщо метою культивування є отримання білкових продуктів, треба зупинити ферментацію до цієї фази. В залежності від генотипу мікроорганізмів та природи рекомбінантного білка під час періодичної ферментації з додаванням субстрату вихід продукту може зрости на 25-1000% у порівнянні з простою періодичною ферментацією. Періодичне культивування з додаванням субстрату можна використовувати для культивування клітин тварин та комах.
Безперервна культура характеризується стаціонарними умовами – видалення клітин урівноважується їх збільшенням за рахунок поділу. Широке розповсюдження набули системи:
Хемостат - сталість хімічних характеристик та складу середовища, у якому знаходяться мікроорганізми Це процес, при якому у культуру з постійною швидкістю безперервно подається свіже поживне середовище, а об’єм культури підтримується на постійному рівні шляхом безперервного видалення частини культуральної рідини. Базується на твердженні – абсолютна концентрація клітин не залежить від поживних речовин, які знаходяться у середовищі і лише від субстрату, якій лімітує ріст. Середовище складають так, щоб усі поживні компоненти були у надлишку у порівнянні з компонентами, які необхідні для синтезу клітини у необхідній концентрації. Цейєдиний компонент, якого не стає лімітує ріст та контролює величину мікробної популяції у сталому стані.
Турбидостат – це культивування де постійна концентрація мікроорганізмів підтримується шляхом регулювання оптичної щільності культури. У разі перевищення встановленого рівня вмикається насос, якій подає свіже середовище.
Система безперервного культивування поршневого типу – дозволяє імітувати періодичне культивування. Використовується лише у лабораторних умовах.
Стерильне та нестерильне культивування.
Ідеальний варіант припускає 100% домінування виробничої культури. Однак, на практиці ця умова не виконується. Реально вдається забезпечити переважний ріст та життєздатність штаму-продуценту. Особливо це має значення на початку ферментації. У подальшому з’являється стороння мікрофлора і завдання біотехнолога створити умови культивування, які б пригнічували ріст сторонньої мікрофлори. Це так звана нестерильна ферментація, яка насправді не існує, тому що створюються такі умови, які забезпечують домінування виробничого штаму над сторонньою мікрофлорою.
Приклад - культивування у безперервних умовах кормових дріжджів, отримання оцтової кислоти при низьких рН, отримання кормового вітаміну В12 та анаеробне бродіння органічних речовин з використанням термофільних мікроорганізмів в температурних умовах 50-55оС. також можна збільшити частку посівного матеріалу до 20-25%.
Аеробне та анаеробне культивування.
Під час аеробного культивування мікроорганізми потребують кисню у середовищі. Це досягається шляхом забезпечення необхідної концентрації розчиненого кисню у рідкому середовищі, шляхом надходження кисню по трубах (барботерах) з малими отворами по всій довжині. При цьому кисень надходить у середовище у вигляді дрібних пухирців, які розчиняються під дією мішалки. Інколи використовують анаеробне культивування, наприклад для отримання вітаміну В12