1.3.2 Фізико-хімічні властивості пуринів, піримідинів, азотистих основ, нуклеотидів та нуклеїнових кислот

Одними з перших розпочали дослідження спектральних властивостей складових НК Longworth J.W, Rahn R.O., Shulman R.G. [3, 40]. В роботі [40] при температурі 77 К було досліджено люмінесценцію пуринів, піримідинів та відповідних нуклеозидів при різних значеннях рН. Виявилось, що при нейтральних значеннях рН фосфоресценція піримідинів не спостерігається, тому зроблено припущення, що центрами фосфоресценції ДНК мають бути пурини. Щодо флюоресценції, то тут внесок дають як пуринові похідні, так і піримідинові. В цій роботі також було отримано спектри люмінесценції піримідинових рибонуклеотидів в розчині етиленгліколь-вода при Т=77 К, рН=7.0 та _ех=270 нм. Показано, що спектри флюоресценції як цитидину, так і уридину характеризуються наявність однієї безструктурної смуги в області 275-400 нм.

Також Gueron M., Eisinger J. та Shulman R.G отримали спектри флюоресценції та фосфоресценції ТМФ, АМФ, ГМФ, ЦМФ та УМФ при T = 77 K. Показано, що лише флюоресценція АМФ та фосфоресценція АМФ і ГМФ мають деяку структуру, максимуми якої відрізняються на   1300 см^-1 [4].

Peon та Zewil отримали за допомогою методу ап-конверсії час життя збуджених станів і квантовий вихід рибонуклеотидів (окрім ТМФ) та нуклеозидів у водному розчині при кімнатні температурі (рис. 1.3.2.2 та табл. 1.3.2.1) [41]. Було помічено що наявність дезоксирибози веде до невеликого збільшення часу життя флюоресцентного стану від 700 до 980 фс. Зокрема час життя збільшується від 690 до 860 фс при переході від гуаніну до ГМФ, та від 760 до 950фс для цитидину та ЦМФ відповідно.

Теоретичні розрахунки впливу рибози та дезоксирибози на фізико-хімічні властивості азотистих основ проведені в роботах [42, 43]. Зокрема, побудовано модель впливу дезоксирибози на шляхи деактивації електронного збудження в ДНК та показано, що її приєднання до основи веде до збільшення сили осцилятора на 50%.

Рис. 1.3.2.2 Спектри поглинання та флюоресценції нуклеотидів. Концентрація 10-4М в 50mM, рН=7 (фосфатний буфер), ех=260 нм.		Нуклеозиди				Нуклеотиди
		А А	Г Г	Т Т	Ц		А А	Г Г	Т Т	Ц Ц
	Максимум флюоресценції нм	310	346	327	324		312	340	330	330
	Кв. вихід Флюоресценції *10-4	0.5	-	1	0.7		0.5	0.8	1.2	1.2
	Час життя (фс) отриманий методом up-conversion	530	690	700	760		520	860	980	950
	Таблиця 1.3.2.1 [41]

Кавалуцці та Борер провели порівняння спектральних характеристик рибо- та дезоксирибонуклеозидів [44]. Зокрема було отримано спектри поглинання нуклеозидів, що дали можливість визначити положення максимумів поглинання та значення коефіцієнтів екстинкції відповідних сполук (табл. 1.3.2.2). Результати свідчать, що складові РНК та ДНК, принаймі в спектрах поглинання, не мають суттєвих відмінностей.

	ε260	εмакс	λмакс
рА pdA pC pdC pG pdG pU pT	15.02 15.06 7.07 7.10 12.08 12.18 9.66 8.56	15.04 15.08 8.74 8.86 14.09 14.23 9.78 9.49	259 259 271 271 252 252 262 267

Табл. 1.3.2.2. Основні характеристики спектрів поглинання для РНК та ДНК нуклеозидів-5^’-монофосфат [44].

Особливу цікавість, через його багатофункціональність в живих організмах, представляє для досліджень аденозин та його похідні. Похідні аденозину, залежно від хімічної модифікації виконують в живій клітині найрізноманітніші функції. Наприклад, у формі ди- та трифосфату аденозин є джерелом енергії для більшості ферментних реакцій та процесів скорочення м’язів [27]. Фотофізичним властивостям даного нуклеозиду присвячені роботи [45,46]. Відомо, що аденін та інші основи можуть перебувати в багатьох таутомерних формах, які характеризуються різними фізико-хімічними властивостями. Дослідженню різних таутомерних форм цитозину, гуаніну, урацилу та можливості їх ідентифікації методами ренгенівської спектроскопії присвячені роботи [47, 48]. Так аденін може перебувати у двох фототропних формах (7Н та 9Н) та кількох іміно (H-N=C) формах. Варто зазначити, що таутомерні форми, на відміну від самого аденіну, флюоресціюють при кімнатній температурі. Було показано, що при кімнатній температурі домінує випромінювання 7Н таутомера [49]. Залежно від розчинника в флюоресценції може з’являтися ще одна смуга. В N⁶,N⁶-диметиладенозині (DMA) на додачу до основної смуги на 330 нм (випромінювання з синглетного стану), з’являється довгохвильовий пік в області 500 нм. Досліджувався DM9EA в розчинниках з різною полярністю. В усіх випадках спостерігалась подвійна флюоресценція. Положення максимуму поглинання (275 нм) практично не залежить від розчинника, чого не можна сказати про два максимуми флюоресценції, положення який зміщується в червону область із збільшенням полярності розчинника [45]. В [46] показано, що флюоресцентні модифіковані бази аденіну та гуанозину можуть бути використані в якості міток для дослідження структури НК та перебігу процесів реплікації та транскрипції.

В [50] проведено порівняння люмінесцентних властивостей пурину та аденіну за допомогою поляризаційних методів. Показано, що спектри пурину та аденіну фактично не відрізняються, окрім максимуму 28500 см^-1 (350 нм), який відсутній в аденіні (табл. 1.3.2.3).

Сполука	Максимум поглинання, см-1	Максимум фосфоресценції, см-1	1Е-3Е, см-1
Пурини Аденін	38200±150 38500±150	25000±150 24600±150	13200 13900

Таблиця 1.3.2.3 Синглет-триплетні інтервали для пуринів [50].

Активні дослідження спектральних властивостей НК та їх складових не втратили актуальності і в наш час, про що свідчить наявність ряду робіт в даній галузі в останні роки [51, 52, 53]. Досліджено випромінювання пуринів, піримідинів, нуклеотидів та нуклеозидів ДНК в склі (EG-H₂O=2:1) при 77 K. Визначено квантові виходи флюоресценції та фосфоресценції при температурі 77 К для рН 6-7: для урацилу та його похідних квантовий вихід варіюється між 0.0002 – для флюоресценції та 0.001 – для фосфоресценції, для гуанозину 0.05 – для флюоресценції та 0.095 – для фосфоресценції. Час життя фосфоресценції при 77 К варіюється від 0.3 с (урацил) до 3 с (аденін). При кімнатній же температурі час життя триплетного стану для тиміну становить 0.6-2.5 мкс, а при Т=77 К – 0.5 с [51, 52].

В [53, 54, 55] досліджувалися часи життя рибо- та дезоксирибонуклеотидів та деяких їх похідних у фосфатному буфері та в газовій фазі. Показано, що найменший час життя синглетного стану характерний для урацилу і варіюється в межах 5.2+2.6 пс, для уридину 4+2 пс. Заміщення атома С5 на метил веде до збільшення часу життя цитидіну та уридину. Для 5-метилцитидіну час життя становить 7.2+0.4 пс, в той час як для цитидіну 720 фс. Тому різниця в часі життя тимідину (540 фс) та уридину (210 фс) пояснюється якраз метилуванням атома С5, а не наявністю групи ОН в рибозі. Також науковцями активно досліджуються штучно синтезовані модифіковані основи НК [56] на основі яких можливе створення нових перспективних нанотехнологій [57, 58].

В галузі дослідження фотофізичних процесів в ДНК було проведено ряд робіт на кафедрі експериментальної фізики КНУ ім. Тараса Шевченка. В роботах [2, 59, 60, 61, 62 ] було досліджено процеси міграції енергії електронного збудження по синглетних та триплетних рівнях ДНК. Перш за все було показано, що нуклеотидні основи ДНК поглинають УФ- випромінювання в основному як окремі центри, отже збудження є локалізованими. Показано, що середня довжина вільного пробігу триплетних збуджень становить 18-20 пар основ [2, 62]. Також було досліджено процеси переносу енергії синглетного електронного збудження при температурі 300К (що дає змогу краще зрозуміти процеси які відбуваються в живому організмі саме при кімнатних температурах) від молекули ДНК до барвника, який діє як пастка.