48. Рівні організації днк, реплікація днк.

В ядрі еукаріот ДНК зв’язана з РНК і білками (хроматин). Розрізняють гетерохроматин (висококонденсований) та еухроматин (менш конденсований), який відповідає ділянкам хромосом з активною транскрипцією. Білки хроматину поділяються на гістонові і не гістонові. Гістони – основні білки, які асоціюються з ДНК. По дві молекули кожного з гістонів Н2А, Н2В, Н3, Н4 складають октамер на який накручена ДНК довжиною 164 п.о. Ця структура називається нуклеосомою. Лінкерна ДНК, яка безпосередньо не контактує з гістоновим октамером, взаємодіє з гістоном Н1, що забезпечує формування соленоїда діаметром 30 нм. Коли хроматин конденсується з утворенням метафазної хромосоми, соленоїдні структури утворюють петлі діаметром 200 нм, які містять 80000 п.о. Петлі зв’язуються з ядерним остовом і 20 петель утворюють мінідиски, а мінідиски хромосому. Негістонові білки регулюють генну експресію.

Реплікація ДНК – це напівконсервативний процес (дочірня молек ДНК скл з материнського ланцюга і новосинтезованого)

Основні етапи реплікації: ініціація, елонгація, термінація. Процес реплікації починається в певній точці одночасно в обох напрямках через утворення реплікативних вилок. Під дією дестабілізуючих білків ДНК набуває форму петель, які перетворюються на ре плікативні вилки. Під час ініціації реплікації до одноланцюговиг ділянок ДНК приєднуються SSB білки забезпечуючи цим ділянкам роль матриці. Для дії ДНК-полімерази ІІІ необхідні праймери (РНК-затравки), до вільного 3’-ОН-кінця, яких приєднуюються дезоксирибонуклеотиди. Полімеризація ДНК відбувається у напрямку 5-3, а матриця зчитується 3-5. ДНК-полімерази ІІІ має нуклеазну активність і може видаляти дефектні нуклеотиди. Після дії ДНК-полімерази ІІІ РНК-затравки видаляються ДНК-полімеразою І і замінюються відповідним дезоксирибонуклеотидом. В процесі реплікації один ланцюг є лідуючим і синтезується безперервно у напрямку 5-3. Інший ланцюг відстаючий синтезується у вигляді фрагментів Оказакі (які потім з’єднує ДНК-лігаза) в напрямку протилежному реплікативній вилці. Термінація синтезу відбувається за допомогою специфічних термінаторів. Для реплікації важливі ДНК-топоізомерази, які розкручують суперспіралізовану подвійну спіраль ДНК, які розплітають ДНК на два ланцюги.

49. Особливості функціонування Са2+, фосфоліпід зал с-м фосфорилювання. Характеристика молекулярних механізмів регуляції Са-кіназ.

Протеїнкінази С беруть участь у інозитолфосфатній системі передачі сигналу. Фермент складається з двох функціонально різних доменів - регуляторного і каталітичного. Регуляторний домен містить 2 структури («цинкові пальці»), утворені фрагментами пептидного ланцюга, багатими цистеїном, і містять 2 іона цинку. «Цинкові пальці» беруть участь у зв'язуванні діацилгліцерола. Інший фрагмент регуляторного домену має високу спорідненість до Са2 +. Підвищення концентрації кальцію в цитозолі збільшує спорідненість протеїнкінази С до фосфатидилсерину мембрани. Транслокація протеїнкінази С до мембрани дозволяє ферменту зв'язатися з ДАГ, який ще більше підвищує спорідненість протеїнкінази С до іонів кальцію. Найбільш поширені ізоформи протеїнкінази С активуються Са2+, діацилгліцеролом і фосфатидилсерином

Каталітичний домен має центр, що зв'язує АТФ і білок-субстрат. Активна форма ферменту протеїнкінази С фосфорилює білки по залишках серину і треоніну. Зниження концентрації іонів кальцію в клітині порушує зв'язок протеїнкінази С з фосфатидилсерином і діацілгліцеролом, фермент переходить в неактивну форму і відокремлюється від мембрани.

Активація протеїнкінази С. • Підвищення конц Са2+ в цитоплазмі клітки збільшує швидкість взаємодії Са2+ з неактивним цитозольним ферментом протеїнкіназою С (ПКС) і білком кальмодуліном, таким чином сигнал, прийнятий рецептором клітини, роздвоюється. • Зв'язування протеїнкінази С з іонами кальцію дозволяє ферменту вступати в кальцій-опосередковану взаємодію з молекулами «кислого» фосфоліпіду мембрани, фосфатидилсерином (ФС). Діацілгліцерол, займаючи специфічні центри в протеїнкіназі С, ще більше збільшує її спорідненість до іонів кальцію. • На внутрішній стороні мембрани утворюється ферментативний комплекс - [ПКС] [Са2+] [ДАГ] [ФС] - активна протеїнкінази С, яка фосфорилює специфічні ферменти по серину і треоніну.Після активації протеїнкінази С фермент переміщується до плазмат. мембрани RACK білками (membrane-bound receptor for activated protein kinase C proteins). Протеїнкінази С відомі своєю довгостроковою активацією: вони залишаються активними після первинної активаційного сигналу або Са2 +-хвилі. Це досягається синтезом ДАГ.

Регуляція. Регуляторний домену аміно-кінця PKCs містить кілька загальних субрегіонів. C1 домен, присутній у всіх ізоформах РКС має обов'язковий сайт зв’язування з ДАГ і форболовими ефірами. C2 домен - Са2 + -сенсор. Псевдосубстратний регіоні невелика послідовність амінокислот, які імітують субстрат і зв'язують порожнину каталітичного домену, зберігаючи фермент неактивним. Коли Ca 2 + і ДАГ присутні в достатній концентрації, вони зв'язуються з C2 і C1 доменами, відповідно, і направляють PKC до мембрани. Ця взаємодія з мембраною призводить до звільнення від псевдосубстратного домену каталітичного сайту і активацію ферментів. Для того щоб ця аллостерична взаємодія відбувалася РКС повинна мати правильну конформацію. Це залежить від фосфорилювання каталітичного регіону. Виділяють три сайти фосфорилювання, які називаються: активаційна петля, поворот-мотив і гідрофобний мотив.

З активацією ПКС пов’язане функціонування інозитолфосфатної системи трансмембранної передачі сигналу, яку забезпечують: R (рецептор), фосфоліпаза С, G-білок, який активує фосфоліпазу С, білки й ферменти мембран і цитозолю.

Послідовність подій, що призводять до активації фосфоліпази С:

• зв'язування сигнальної молекули, наприклад гормону з рецептором (R), викликає зміну конформації і збільшення спорідненості до G-білку.

• утворення комплексу [Г] [R] [Gбілок-ГДФ] призводить до зниження спорідненості альфа-протомер G-білка до ГДФ і збільшення спорідненості до ГТФ. ГДФ замінюється на ГТФ.

• це викл дисоціацію к-су; відокремлена α-субодиниця, зв'язана з молекулою ГТФ, набуває спорідненість до фосфоліпази С.

• альфа-ГТФ взаємодіє з фосфоліпазою С та активує її. Під дією фосфоліпази-С відбувається гідроліз ліпіду мембрани фосфатидилінозитол-4,5-бісфосфата (ФІФ2).

• в ході гідролізу утворюється і виходить в цитозол гідрофільна речовина інозитол-1,4,5-трифосфат (ІФ3). Інший продукт реакції діацілгліцерол (ДАГ) залишається в мембрані і бере участь в активації ферменту протеїнкінази С (ПКС).

• інозитол-1,4,5-трифосфат (ІФ3) зв'язується специфічними центрами Са2+-каналу мембрани ЕР, це призводить до зміни конформації білка і відкриття каналу - Са2+ надходить в цитозоль. За відсутності в цитозолі ІФ3 канал закритий.

Участь кальмодуліну. У клітинах багатьох тканин присутній білок кальмодулін, який функціонує як внутрішньоклітинний рецептор Са2+, він має 4 центри для зв'язування Са2+. Комплекс [кальмодулін]-[4 Са2+] не має ферментативної активністі, але взаємодія комплексу з різними білками і ферментами призводить до їх активації.