26. Роль білків в процесі реплікації. Поcтреплікативні модифікації днк. Роль рестриктаз у збереженні „чистоти” ген. Інформації.

В реплікації ДНК, яка включає впізнавання точки початку процесу, розплітання батьківських ланцюгів ДНК в реплікативній вилці, ініціацію біосинтезу дочірніх ланцюгів і подальшу елонгацію і термінацію процесу, бере участь більше 40 ферментів і білкових факторів, об’єднаних в єдину ДНК-репліказну систему, яка називається реплісомою.

Ферменти біосинтезу ДНК у прокаріотів:

1) ДНКполімераза І— білок з м.м. 103 кД. Біохімічні функції:

5' → 3' — полімеразна активність;

5' → 3'— екзонуклеазна активність (тобто спроможність видаляти нуклеотиди вище від напрямку синтезу);

3' → 5' —екзонуклеазна активність ("коригуюча" активність);

2) ДНК-полімераза II (білок з м.м. 120 кД) не є основним в реплікації ДНК у прокаріотів; за уявленнями, шо існують, переважною функцією цього ферменту є участь у репарації ДНК;

3) ДНК-полімераза III — головний фермент, що реалізує процес елонгації ДНК у Е.Соli.

За своєю молекулярною будовою ДНК-полімераза ПІ є асиметричним димером з м.м. близько 900 кД. Це мультисубодиничний фермент, ціла молекула якого (холофермент) містить у своєму складі 10 типів субодиниць — поліпептидних ланцюгів.

Фермент має 5' → 3' -полімеразну, 3' → 5' -екзонуклеазну та АТФ-азну активності. ДНК-полімераза Ш є високопроцесійним ферментом, що може, не залишаючи матрицю, каталізувати сполучення в ланцюг багатьох тисяч мононуклеотидів (на відміну від 15-20 нуклеотидів при дії ДНК-полімерази І). Швидкість полімеразної реакції складає близько 1000 нуклеотидів за секунду.

Ферменти біосинтезу ДНК в еукаріотів: у клітинах еукаріотів знайдено декілька типів ДНК-полімераз: , β, γ, δ, ε.

Ферментами, що відіграють основну роль у реплікації ДНК в еукаріотів, є ДНК-полімерази  та δ , які є високопроцесійними ферментами з 5' → 3'-полімеразною активністю. Полімерази β та ε беруть участь в репарації ядерної ДНК, а γ -полімераза відповідає за реплікацію мітохондріальної ДНК.

Вміст ДНК-полімерази  зростає під час S-фази клітинного циклу, коли відбувається активний синтез ДНК. Активність ДНК-полімераз , δ та ε специфічно блокується афідиколіном — дитерпеноїдом з грибів, що діє як антипухлинний антибіотик.

Топологічні проблеми реплікації ДНК. Розплетення та відокремлення 2 ланцюгів ДНК, що передує синтезу дочірніх ланцюгів, реалізується при дії спец білків:

• ферментів топоізомераз, які забезпечують зміну кількості супервитків у кільцевих замкнутих молекулах ДНК. Топоізомерази, і, зокрема ДНК-гіраза прокаріотів здійснюють у зачіплених нитках ДНК розриви полінуклеотидних ланцюгів, що створює механічні передумови для їх роз­кручування. Топоізомерази присутні також у хроматиновому апараті еукаріотів: вони вносять дволанцюгові розриви в довгі лінійні ДНК хромосом, забезпечуючи підготовку останніх до реплікації;

• ферментів хеліказ (helix — спіраль, англ.), що в АТФ-залежному процесі розкручують, розплітають короткі ділянки ДНК, утворюючи реплікативні вилки —місця послідовного розплетення подвійного ланцюга та синтезу нових ниток ДНК:

• білків, що зв 'язують однониткові ДНК (SSB-білки — single strand binding). протидіючи їх ренатурації.

Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК

1. Ініціація синтезу полідезоксирибонуклеотидних ланцюгів ДНК, якій передує утворення "затравних" (праймерних) ланцюгів РНК (РНК-праймерів), до 3'-ОН-груп яких здатні приєднуватися дНМФ, що утворюють нові (дочірні) ланцюги ДНК. Довжина цих праймерних ланцюгів складає в середньому від 10 до 200 нуклеотидів. Синтез РНК-праймерів відбувається за участю ферментів РНК-полімераз — так званих праймаз.

2. Елонгація синтезу-ДНК, яка відбувається за різними механізмами на лідиру­ючому та відстаючому ланцюгах.

2.1. На лідируючому ланцюгу нарощування дНМФ здійснюється ДНК-полімеразою IIІ, що функціонує безперервно, утворюючи ланцюг ДНК від РНК-праймера до реплікативної вилки.

2.2. На відстаючому ланцюгу: а) спочатку при дії ДНК-полімерази III синтезуються окремі фрагменти Оказакі, кожен з яких починається з відповідного РНК-праймера і закінчується перед початком передуючого йому РНК-праймера; б) після формування фрагментів Оказакі ДНК-полімераза І, за рахунок своєї 5'→3'-екзонуклеазної активності видаляє РНК-праймери і (за рахунок 5'→3'-полімеразної активності) заміщує їх фрагментами ДНК; в) розриви між окремими фрагментами Оказакі зшиваються спеціальним ферментом ДНК-лігазою.

Постреплікативні модифікації ДНК. Рестриктази (рестрикційні ендонуклеази) — ферменти, присутність яких в бактеріальній клітині "обмежує" можливість розмноження в них певних бактеріофагів за рахунок розщеплення рестриктазами фагових ДНК. Наз­ви рестриктаз грунтуються на наз­вах штамів бактерій, з яких їх виді­ляють: наприклад, рестриктази Eco RI та Eco RII походять з R-штаму Е.Соlі.

Рестриктази розщеплюють дволанцюгову ДНК лише в ділянках певних нуктеотидних послідовностей (4-7 ао, які мають структуру паліндромів), що дозволяє вик ці ендонуклеази для "розрізання" молекул ДНК в суворо визначених сайтах. Наприклад, рестриктаза Eco RI гідролізує зв'язки між G та А в таких послідовностях:

...GAATTC...

...CTTAAG...