47. Транскрипція, ферменти транскрипції і її регуляція. Реорганізація хроматину при транскрипції.

Транскрипція – перша стадія реалізації генетичної інформації в клітини. В ході процесу утворюються молекули мРНК, які слугують матрицею для синтезу білків, тРНК, рРНК.

Транскрипція у еукаріот відбувається в ядрі. В основі механізму транскрипції лежить принцип комплементарного спарювання основ у молекулі РНК (G = С, А = U і Т = А). ДНК слугує тільки матрицею і в ході процесу транскрипції не змінюється. Рибонуклеозидтрифосфати (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ) - субстрати та джерела енергії, необхідні для протікання полімеразної реакції та утворення 3',5'-фосфодиефірного зв'язку між рибонуклеозидмонофосфатами.

Синтез молекул РНК починається в певних послідовностях (сайтах) ДНК, які називають промотори, і завершується в сайтах термінації. Ділянка ДНК, обмежена промотором і сайтом термінації, являє собою одиницю транскрипції - транскриптон. У еукаріот до складу транскриптону, як правило, входить один ген, у прокаріот декілька. У кожному транскриптоні є неінформативна зона; вона містить специфічні послідовності нуклеотидів, з якими взаємодіють регуляторні транскрипційні фактори.

Транскрипційні фактори - білки, що взаємодіють з певними регуляторними сайтами і прискорюють або сповільнюють процес транскрипції. Співвідношення інформативної та неінформативної частин у транскриптонах еукаріот становить у середньому 1:9 (у прокаріот 9:1).

Синтез ланцюга РНК йде від 5'- до З'-кінця. Транскрипція не пов'язана з фазами клітинного циклу; вона може прискорюватися і сповільнюватися в залежності від потреби клітини або організму в певному білку.

РНК-полімерази. Біосинтез РНК здійснюється ДНК-залежними РНК-полімеразамт. У ядрах еукаріот виявлено 3 спеціалізовані РНК-полімерази: РНК-полімераза I, синтезує пре-рРНК 18S, 28S, 5.8S; РНК-полімераза II, відповідальна за синтез пре-мРНК; РНК-полімераза III, синтезує пре-тРНК, рРНК 5S та кілька інших низькомолекулярних РНК. РНК-полімерази - олігомерні ферменти, що складаються з декількох субодиниць - 2α, β, β', σ. Субодиниця σ (сигма) виконує регуляторну функцію, це один з факторів ініціації транскрипції. РНК-полімерази I, II, III, які впізнають різні промотори, містять різні за будовою субодиниці σ.

Стадії транскрипці. У процесі транскрипції розрізняють 3 стадії: ініціацію, елонгація і термінацію.

Ініціація

-Зв'язування голофермента з промотором (еукаріоти - ТАТА-бокс). У результаті формується закритий комплекс, у складі якого ДНК зберігає форму подвійної спіралі.

-Локальне плавлення подвійної спіралі з утворенням відкритого комплексу – розходження ланцюгів ДНК, яке дозволяє використовувати один з них у якості матриці.

-Включення перших двох нуклеотидів до молекули РНК (синтез першого фосфодіефірного зв'язку в активному центрі полімерази) – найбільш повільна стадія процесу.

-Зростання первинного короткого транскрипту – приєднання 8-9 нуклеотидів. Після цього є можливою абортивна ініціація (визволення короткого транскрипту) – невдала спроба ініціації.

-У іншому випадку відбувається очищення промотора – дисоціація σ-фактора, яка є переходом до елонгації транскрипці.

Елонгація

Фактори елонгації підвищують активність РНК-полімерази і полегшують розходження ланцюгів ДНК. Синтез молекули РНК йде від 5'-до З'-кінця комплементарно матричному ланцюгу ДНК. На стадії елонгації, в області транскрипційної вилки, одночасно розділені приблизно 18 нуклеотидних пар ДНК. Зростаючий кінець ланцюга РНК утворює тимчасову гібридну спіраль, близько 12 пар нуклеотидних залишків, з матричним ланцюгом ДНК. У міру просування РНК-полімерази по матриці (транслокації) в напрямку від 3'- до 5'-кінця попереду неї відбувається розходження, а позаду - відновлення подвійної спіралі ДНК. Під час елонгації здійснюється також редагування помилок. Зокрема, джерелом (одним з основних) помилкового приєднання нуклеотидів під час транскрипції є таутомерія азотистих основ. Спонтанні перебудови електронних систем гетероциклів призводять до того, що кожна основа існує у вигляді двох таутомерних форм: аміно- чи іміно-форми для A, C; енольної чи кето-форми для G, U, T.

Термінація

Розкручування подвійної спіралі ДНК в області сайту термі нації (паліндромна послідовність, утв. шпильку) робить його доступним для фактора термінації. Завершується синтез РНК у певних ділянках матриці – термінаторах (сайти термінації). Фактор термінації полегшує відокремлення первинного транскрипту (пре-мРНК), комплементарного матриці, і РНК-полімерази від матриці. РНК полімераза може вступати в наступний цикл транскрипції після приєднання субодиниці σ.

Регуляція транскрипції. Кілька десятків тисяч еукаріотичних генів потребують диференційної активації / репресії в певні моменти залежно від типу клітин, стадії розвитку, зовнішніх умов тощо.

Транскрипційні фактори. Як і в прокаріотів, ключовими елементами системи регуляції транскрипції є регуляторні цис-елементи послідовності (проксимальні та дистальні елементи промоторів) і транс-регулятори білкові транскрипційні фактори (ТФ, під якими будемо розуміти специфічні, не базальні, фактори транскрипції). Цис-елементи – це регуляторні елементи послідовності ДНК, які фізично зв'язані з даним геном чи опероном; у прокаріотів часто називаються операторами і знаходяться у безпосередній близькості до промоторів. Транс-елементи – білкові фактори транскрипції, що вільно дифундують (транспортуються) у просторі клітини, шукаючи свій цис-елемент, до якого вони мають специфічну спорідненість. Якщо зв'язування транс-елемента з оператором призводить до активації транскрипції (часто за рахунок прямих білок-білкових взаємодій транскрипційного фактора з РНК-полімеразою, які підвищують її спорідненість до промотора), кажуть, що фактор є активатором і здійснює позитивну регуляцію. Якщо фактор блокує зв'язування РНК-полімерази (часто за рахунок зниження доступності промотора), його називають репресором (repressor) і кажуть про негативну регуляцію.

Регуляція транскрипції та структура хроматину. Суттєвою особливістю еукаріотів є та обставина, що ДНК клітинного ядра організована у складні хроматинові структури. Нуклеосоми та хроматинова фібрила в цілому виступають як загальний репресор генної активності. Тим самим вони допомагають забезпечити загальну інактивацію більшості генів в еукаріотичній клітині, за винятком тих, чия активація здійснюється за участю ТФ. Активація транскрипції потребує перебудов структури хроматину в напрямку деконденсації хроматинової фібрили та визволення цис-елементів від нуклеосом. Для реалізації таких перебудов є два основні інструменти, які діють у тісній координації один з одним: система посттрансляційних модифікацій гістонів і АТР-залежні комплекси ремоделювання хроматину, що проводять репозиціювання нуклеосом. Специфічна картина (патерн) гістонових модифікацій відіграє також і зворотну роль - у здійсненні гарантованої репресії певних ділянок хроматину.

Серед інших модифікацій, ацетилювання залишків Lys (у певних консервативних позиціях) майже завжди корелює з активацією транскрипції. НАТ входять до складу мультибілкових комплексів, які часто є компонентами енхансосом. Часто у складі НАТ присутні бромодомени - структурні модулі, що мають специфічну спорідненість до ацетильованих лізинів. Тобто НАТ упізнають Lys, уже ацетильовані іншими НАТ, і здійснюють ацетилювання сусідніх нуклеосом, підтримуючи таким чином ацетильований статус певної ділянки хроматину. Ацетилування гістонів сприяє деконденсації хроматинової фібрили за рахунок зниження позитивного заряду головних факторів конденсації, якими є гістонові хвости.

Підвищення доступності промоторів під час їхньої активації потребує також інших спеціальних механізмів. Справа в тому, що за фізіологічної іонної сили електростатичні взаємодії ДНК і гістонів дуже міцні й нуклеосома зберігає високу стабільність, яка практично виключає навіть переміщення нуклеосоми вздовж ДНК. Оскільки переміщення нуклеосом є необхідним для експонування регуляторних сайтів на ДНК до дії транскрипційних факторів, у клітині існує спеціальна система: комплекси ремоделювання хроматину (КР), які часто є компонентами енхансосом. КР є АТР-залежними мультибілковими молекулярними машинами, які забезпечують переміщення нуклеосом уздовж хроматинової фібрили (репозиціювання) і сприяють тимчасовому видаленню нуклеосом із активних промоторів на білки, що є проміжними переносниками гістонів.