17. Біохімічні основи регуляції клітинного циклу. Роль білка mpf, білків сімейства циклінів, ростових факторів та циклін-залежних кіназ.

Циклінзалежні кінази (Cdk) - протеїнкінази, що фосфорилюють білки фаз кл циклу і т.ч. активують або інгібують їх.

Cdk функціонує в комплексі з цикліном (він активує кіназу, визначає її субстратну специфічність).

Циклін-Cdk – гетеродимерний к-с (циклін відіграє роль регуляторної (активаторної) субодиниці, а Cdk – каталітичної).

Регуляція експресії генів Cdks. К-си G1-періоду (циклін D–Cdk4,6 та циклін Е–Cdk2), окрім інших різноманітних впливів, запускають транскрипцію гену Cdk1.

Регуляція активності Cdks. Зв’язування активаторної субодиниці – цикліну. Зв’язування інгібіторної субодиниці. Інгібіторами Cdk є білки двох родин – INK4 (p15, p16) та КІР1 (р21, р27, р57), які перешкоджають активації Cdks.

Фосфорилювання/деф Cdks сецифічними кіназами/фосфатазами, що призводить до їх активації чи інгібування.

Синтез циклінів: кінцевою мішенню дії мітогенних факторів часто є ген цикліну D.

Розпад циклінів: убіквітинзалежний протеоліз. Циклін В–Cdk1 (MPF) фосфорилює певні білки і стимулює вхід кл в мітоз, але для завершення мітозу рівень MPF має зменшитись. Це забезпечується так: під час метафази мітозу MPF фосфорилює, окрім інших білків, фактор APC – убіквітинлігазу, специфічну до MPF. АРС швидко приєднує молекули убіквітину до цикліну В, який після цього швидко руйнується в протеосомі. Синтез інгібіторів Cdks: в деяких регуляторних шляхах білки родини Smad стимулюють синтез р15, р21 та інших інгібіторів, в результаті чого поділи припиняються.

Заг. принцип циклу. К-кс циклін–Сdk чергової стадії циклу забезпечує: інактивацію к-ксу поперед. стадії, стимуляцію подій поточної стадії, утв-ня або активацію к-сів наступної стадії. Тобто діє ланцюговий механізм, в якому кожна стадія процесу готує умови для наступної стадії, причому після проходу точки рестрикції процес іде незалежно від зовнішніх стимулів.

Механізм дії комплексів G1-періоду.Комплекси циклін D–Cdk4,6 фосфорилюють білок pRbта подібні до нього білки р105 та р130. Білок pRb в нефосфорильованому стані інгібує транскрипційні фактори E2FiDP. Після фосфорилювання pRb дисоціює, а комплекс E2F-DP активується і набуває здатності стимулювати експресію цілого ряду генів, серед них:гени циклінів Е, А та Cdk1,2, гени самих факторів E2F(позитивний зворотний зв’язок, самопідтримання процесу), гени ключових ферментів синтезу ДНК (підготовка до S-періоду), гени наступних транскрипційних факторів, що стимулють в кінці G1-періоду синтез цикліну В. Фосфорилювання та інактивація АРС (anaphasepromotingfactor) – убіквітинлігази, яка стимулює швидкий протеоліз цикліну В. Як наслідок, рівень цикліну В продовжує зростати до метафази мітозу.Фосфорилювання та інактивація інгібіторів комплексів циклін A–Cdk2 та циклін В–Cdk2. звільнені від інгібуючого впливу комплекси вводять клітину в S-період.

Механізм дії комплексів S- та G2-періодів (циклін А–Cdk2, циклін B–Cdk1,2). Контроль 1-разової реплікацї ДНК; утворення компонентів MPF – цикліну В та Cdk1; гальмування активності цього к-су і запобігання передчасному входу кл в мітоз.

Профаза та метафаза мітозу: механізм дії MPF (циклін В–Cdk1).Конденсація хромосом. MPF фосфорилює гістон Н1 та білки SMS(structuralmaintananceofchromosomes) з утворенням компактних метафазних хромосом.Розпад ядерної оболонки. MPF фосфорилює білки ядерної ламіни, що призводить до їх дисоціації, при цьому ядерна мембрана розпадається на дрібні везикули.Формування веретена поділу. MPF фосфорилює тубулін з утворенням мікротрубочок веретена.Затримка передчасної цитотомії. MPF фосфорилює легкі ланцюги міозину, що запобігає їх взаємодії з актином і утворенню кільця до того моменту, поки хромосоми не розійдуться до полюсів клітини.

Анафаза і телофаза мітозу: дія АРС і протеїн фосфатаз. АРС (убіквітинлігаза, що сприяє швидкому протеолізу ряду білків, в тому числі і MPF) фосфорилюється і активується MPF в метафазі мітозу.Маркує до протеолізу білки-інгібітори анафази, що входять до складу центромерних комплексів, які утримують сестринські хроматиди від розходження.Маркує до протеолізу MPF в пізній анафазі. Після цього фосфатази дефосфорилюють білки, що були фосфорильовані MPF в метафазі. Це призводить до відновлення ядерної оболонки, деконденсації хромосом, утворення актоміозинового кільця і цитотомії.

Сигн. шляхи, пов’язані з Cdk. Більшість сигн шляхів, що регулюють проліферацію кл, спрямована на комплекси G1-періоду (циклін D–Cdk4,6 Е – Cdk2).Зовнішній стимул призводить до активації тирозинкінази, асоційованої з рецептором. Далі каскад МАРК, фосфорилювання певних транскрипційних факторів (Elk, Ets, ATF2, Tcf тощо) та активація ними генів ранньої відповіді (FOS, JUN).FosiJun – транскрипц ф-ри, що активують гени пізньої відповіді, і серед них – гени цикліну D, Cdk4, Cdk6.

Результат впливу мітогенів: Підвищення вмісту в клітині цикліну D та Cdk4, Cdk6; Зниження вмісту інгібіторів Cdks; Дефосфорилювання і підвищення активності Cdk4, Cdk6, а також Cdk2.

Це забезпечує накопичення в клітині активних комплексів циклін D–Cdk4,6. Вони починають готувати клітину до поділу.

Висновки: Кл цикл – самопідтримуваний процес, який після запуску регулюється внкл ф-рами незал від мітогенних стимулів. Факторами, які регулюють перебіг кл циклу, є цикліни та циклінзалежні кінази, які в к-ксі фосфорилюють білки-мішені, активуючи або інактивуючи їх. Завдяки складній системі + та - зворотних зв’язків фази мітозу відбуваються строго послідовно, оскільки ефекторні молекули кожної фази створюють умови для переходу до наступної.

Щоб розпочався кл цикл, необхідне утв-ня к-су транскрипційних факторів, що активують експресію генів ранньої в-ді. Отже, для вступу в мітотичний цикл необхідне виконання трьох умов: відсутність міжклітинних контактів, прикріплення клітини до субстрату, позаклітинний стимул (ростовий фактор).