99 кругов АДА

к ДНК-зонды методом гибридизации in situ. Представляя экспрессируемые участки, кДНК позволяет выявить наиболее значимые с биологической и медицинской точек зрения районы генома. Карта кДНК может помочь в хромосомной локализации генов, функции которых ещё неизвестна.

Существует два общих подхода к построению физической карты участка генома с высоким уровнем разрешения: картирование «сверху вниз» (макрорестрикционная карта) и «снизу вверх» (карта контиг). В обоих случаях карта представляет собой упорядоченный набор фрагментов ДНК. Фрагменты размножают клонированием или с помощью полимеразной цепной реакции, разделяют гель-электрофорезом и выявляют при окрашивании или гибридизации с меченым зондом. Для воссоздания оригинальной последовательности фрагментов (той последовательности, в которой они находятся в геноме) используют различные методы поиска перекрывающихся участков.

Необходимой ступенью при построение крупномасштабных физических карт является получение большого количества фрагментов ДНК картируемого участка. Существует два основных способа амплификации («размножения») ДНК – клонирование (размножение фрагментов в составе комбинантных молекул ДНК в клетках чужеродного хозяина) и амплификация в полимеразной цепной реакции (ферментативный синтез фрагментов ДНК).

43. Клонирование гена. Векторы для клонирования. Искусственная хромосома дрожжей (УАС), космида, плазмида.

Клонирование (амплификация ДНК in vivo) размножение фрагментов в составе рекомбинантных молекул ДНК в клетках чужеродного хозяина (полученные чаще всего при рестрикции геномной ДНК) объединяют с кольцевой молекулой (вектором), разрезанную той же рестриктазой.

Полученную рекомбинантную (т.е. содержащую ДНК разного происхождения) молекулу затем вводят в подходящие клетки, которые можно размножать в практически неограниченных количествах. Векторами служат обычно молекулы ДНК вирусного, бактериального или дрожжевого происхождения. Они могут нести вставки чужеродной ДНК от 12000 п.о. (бактериальные плазмиды и космиды) до 1 Мб (искусственные хромосомы дрожжей). В качестве клеток-хозяев используют обычно бактерии, хотя применяют и клетки млекопитающих. В процессе деления клеток-хозяев (роста клона) ДНК человека в составе вектора реплицируется вместе с геномом клетки.

Набор клонированных фрагментов ДНК называют библиотекой клонов. Геномная библиотека представляет собой набор клонов, содержащих перекрывающиеся участки ДНК, охватывающий весь геном. Существуют и хромосомные библиотеки – набор клонов, содержащий фрагменты ДНК определенной хромосомы.

Векторы для клонирования больших – до 1 Мб – участков ДНК поддерживают в клетках дрожжей как искусственные хромосомы (YAC - искусственная дрожжевая хромосома). До внедрения YAC самые крупные векторы – космиды – могли нести вставки максимум в 20-40 Кб. Применение YAC позволяет значительно уменьшить число клонов, которые нужно упорядочивать. Подробную карту YACа можно получить при субклонировании – процессе, в котором фрагменты первоначальной большой вставки клонируются в более мелких векторах.

Космида – плазмиды, содержащие фрагмент ДНК фага лямбда включая cosучасток. Вместе с системами упаковки в фаговые частицы in vitro используется как векторные молекулы для клонирования генов и при построении геномных библиотек.

Плазмида – небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от хромосом и способные реплицироваться автономно.

44. Принципы секвенирования ДНК

Секвенированием называют процесс выявления последовательности нуклеотидов ДНК. Современные процедуры секвенирования включают, вопервых, субклонирование фрагментов ДНК из космид или библиотеки бактериофагов в специальные векторы для секвенирования, которые несут небольшие части клонированных фрагментов. Следующим шагом является преобразование субклонированных фрагментов в набор молекул ДНК, различающихся по длине только на один нуклеотид. Высокоразрешающие методы электрофореза позволяют разделить этот набор фрагментов и считать последовательность оснований.

Каждая реакционная пробирка (для T, С, G, A) при секвенировании дидеокси-методом содержит

-ДНК-матрицу, праймер и ДНК-полимеразу для инициации синтеза новой цепочки в точке, где праймер гибридизуется с матрицей

-4 дезоксиниклеотидтрифосфата (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) из которых синтезируется цепь ДНК

-один радиоактивно меченый дезоксинуклеотидтрифосфат

- один ди-дезоксинуклеотидфосфат, при включении которого в цепочку ее рост завершается (в пробирке А это di-dATP и т.д.)

В каждой из пробирок соотношение dNTP и di-dNTP подобрано таким образом, чтобы синтезировался набор фрагментов ДНК с di-dNTP, включенным в каждую позицию данного основания на матричной ДНК. Набор фрагментов для каждого из нуклеотидов затем разделяют в одном геле на 4ех параллельных дорожках. Фрагменты разделяют по длине; чем короче фрагмент (и, следовательно, чем ближе данное основание к началу секвенируемого участка), тем быстрее он движется и тем ближе к концу геля он оказывается. Последовательность считают снизу вверх.

45. Митохондриальный геном (М-хромосома). Размер и структура. Копийность ядерного и митохондриального генома.

Митохондриальная ДНК (мтДНК) или, как её ещё называют хромосома М, представляет собой небольшую кольцевую молекулу длиной 16569 п.о. В отличие от ДНК ядерного генома она не связана с белками, а существует в митохондриях в «чистом виде». Ещё одно важное отличие мтДНК от хромосомной – очень высокая «плотность генов». В митохондриальных генах отсутствуют интроны, а межгенные промежутки. В результате эта очень небольшая молекула содержит 13 генов, кодирующих белки (3 субъединицы цитохром с-оксидазы, 6 компонентов АТФ-азы и др.) и 22 гена тРНК.

Каждый из ядерных клеток в большинстве клеток в двух копиях – по одной на каждой хромосоме, митохондриальные имеют большую копийность – несколько тысяч на клетку. Каждая митохондрия имеет от 2 до 10 копий мтДНК. Также как и для ядерной ДНК, для генома митохондрий характерны межиндивидуальные различия. В то же время, мтДНК одного индивида, как правило, идентична.

На мтДНК в миниатюре достигнута цель, которую преследуют исследователи генома – митохондриальная ДНК полностью секвенирована

ина ней выявлены все структурные гены.

46.Структура гена. Экзоны, интроны, регуляторные области, спейсеры.

Функциональной единицей генома человека является отдельный ген. Средний по размеру ген человека имеет кодирующую часть общей длиной в несколько тысяч пар оснований. Однако, общая длина гена значительно больше, поскольку кроме экзонов (кодируют) в состав гена входят интроны

и участки, располоденные до (с 5’ - конца) и после (с 3’-конца) кодирующей части.

Наиболее рациональна гипотеза Джилберта: экзоны соотвествуют доменам белка, и в процессе эволюции гены белков собирались из соответствующего «набора» экзонов. Вполне возможно также, что функция интронов в том, чтобы обеспечить место для кроссинговера без разрыва кодирующих фрагментов и, следовательно, без нарушения функции домена.

Интроны вырезаются из первичного транскрипта гена в процессе формирования зрелой мРНК.

С учетом интронов общая длина генов возрастает подчас до десятков раз. Кодирующая часть гена начинается всегда с метионинового кодона (из

зрелого белка этот метионин удаляется). До начала кодирующей части расположены участки регуляции транскрипции. В районе 25-30 нуклеотидов «выше» (с 5’-конца) сайта инициации транскрипции в генах большинства эукариот, в том числе и человека, расположен участок, обогащенный А и Т, ТАТА-бокс. Ещё одна регуляторная последовательность – САТ-бокс – расположена в районе 70-80 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции.

Межгенные участки ДНК – спейсеры, функция их невыяснена. У человека самым распространённым семейством таких последовательностей являются Alu-повторы, названные так из-за того, что они содержат сайт рестрикции для нуклеазы AluI. В геноме человека насчитывается несколько сотен тысяч копий Alu-повторов в спейсерах и интронах. (298-300 н)

-STR (2-6 н) – микросателлиты

-VNTR (варабилити намбер тамбер репид) – минисателиты (7-50 н)

Энхансеры – увеличивают скорость транскрипции, сайленсоры – уменьшают или прекращают.

47. Вариабельность генома человека. Уровень вариабельности. Полиморфизм и мутации. Типы полиморфизма ДНК.

Последовательность ДНК величина не постоянная. Две случайно выбранный хромосомы отличаются, в среднем, по 1 нуклеотиду из каждых 500. Последовательность ДНК двух неродственных людей отличается примерно на 0,2%. Именно эти проценты и определяют всю разницу между людьми.

- мутации в терминирующих кодонах (TAA, TAG, TGA), которые приводят к синтезу длинных (длиннее нормального) белковых продуктов

49. Принцип и применение блотт-гибридизации по Саузену

Используется для выявления определенной последовательности ДНК в образце

1.Выделяется ДНК у любой ядросодержащей клетки (чаще это лейкоциты)

2.Тотальная ДНК обрабатывается одной определенной рестриктазой: накопление рестрикционных фрагментов разной длины

3.Ставят электрофорез в огорозном или полиакриламидном геле (ПАА)

4.На влажный гель кладут нитроцеллюлозный/нейлоновый фильр. Во влажной среде осмотическим током жидкости происходит перенос фрагментов ДНК с влажного геля на фильтр, там образуется реплика ДНК-рестрикта

5.При переносе в щелочной среде ДНК денатурирует (т.е становится одноцепочечной)

6.В таком состоянии ДНК гибридизуется с меченным ДНК-зондом на исследуемый фрагмент (перенос продолжается от 12 до 24 ч зависит от длины фрагмента)

Гибридизация – образование 2нитевых структур ДНК-ДНК или ДНКРНК Зонд – короткий одноцепочечный фрагмент ДНК, искусственно

синтезируемый комплементарный искомой последовательности и меченный флуоресцентной или радиактивной меткой

7.Для гибридизации фильтр кладут в полиэтиленовый пакет, туда же буфер и зонд. Продолжается 12 часов и более, при температуре 68-70 градусов Цельсия

8.После гибридизации отмывают и фиксируют метку с помощью рентгеновской пленки, если метка радиоактивна или микроскопируют, если метка флуоресцента.

Вестерн-блотт – работа с белками Нозерн-блотт – гибридизация РНК Истерн –блотт – посттрансляционные белки

50. Принцип и применение полимеразной цепной реакции

- это экспериментальный метод, направленный на многократное копирование (амплификацию определенных фрагментов ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов)

Анализируемая копия ДНК массой 2 нанограмма (нг)

+комплементарный олигонуклеотидные праймеры ограничивающие участок ДНК

+новые дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP = dATP+dTTP+dGTP+dCTP)

+фермент TaqДНК-полимераза (остается активной при 100

гр.Цельсия)

+Среда буфер: калий, магний, сульфат аммония

+консольвенты – вещества поддерживающие ДНК в одноцепочечном состоянии (DMSO)

+доводят до нужного объема деионизированной водой

Цикл:

1.Денатурация (97-98 градусов)

2.Гибридизация на специфических последовательностях (отжиг от 52-70) зависит от того каким локусом становится – отжиг 58градусов

3.Синтез – локация цепи (72) 1 цикл: 5:1:1

29 циклов: 0,5:1:1

Последний: 0,5:1:7 Последующие повторы приводят к множественной амплификации ДНК в

процессе количество копий увеличивается с одной до 10^9

Накопление нужного фрагмента идет по экспоненте, где n – число циклов

2n-2n

Праймер – одноцепочечный искусственно синтезируемый фрагмент ДНК Длина 20-30 нуклеотидов, содержит C и G не более 65%, прямой и обратный праймер не должны содержать длинных последовательностей комплементарных друг другу, ориентирутся так, чтобы синтез протекал между ними

Виды ПЦР: реал-тайм, гнездовая, аллель специфичная, метилчувствительная

Применение: диагностика инф.заболеваний, наследственных и онкологических заболеваний, научные исследования, определение родства, криминалистика, в пищевой промышленности

51. Методы разделения фрагментов ДНК. Электрофорез в агарозных и полиакриамидных гелях.

- стандартный метод используется для разделения и идентификации фрагментов ДНК.

Существуют: вертикальный – ПАА, горизонтальный – агарозный гель

При разделении следят за тем как полосы ДНК окрашиваются флуоресцентом и интерколлируют вставляются между в бромистом этиде. Просматривают гель под УФ, можно заметить даже 1 гр ДНК

Скорость миграции ДНК в геле зависит от:

-длины/массы молекулы ДНК – продвигается одним концом вперед со скоростью обратно пропорциональной десятичному логарифму их мол.массе

-напряженность электрического поля, которая прикладывается к камере (максим. 5В/см)

-концентрация геля (чем больше концентрация, чем меньше скорость)

-от конформации ДНК: цепочечная/кольцевая

-состав оснований

-температура (только для ПАА)

Приспособления:

1.Электрофоретическая камера (кювета в которой размещается гель в которой размещается два мм буфера)

2.Буфер: трис-ацетат-ЭДТА, трис-борат-ЭДТА

3.Полимер: агароза – порошок, который получают из красных водорослей, ПАА – акриламид + бисакриламид – готовят и вливают в подложку

4.Вставляют гребенку, и остужают гель до полной кристаллизации

5.В образовавшиеся лунки наносят пробы ДНК (ДНК+1/10объема бромфеноловый синий)

6.Гель в камеру, заливают буфером

7.Подключают напряжение

8.Через 30-60 минут смотрят под УФ

Вертикальным форезом можно добиться разделения даже в один нуклеотид, идет при более высоком напряжении, фактор полимеризации – свет и красится после электрофореза

52. Подходы к ДНК-диагностике наследственных болезней. Прямая и косвенная диагностика.

ДНК-диагностика - совокупность методов молекулярной биологии, направленных на выявление таких изменений в молекуле ДНК, которые лежат в основе формирования наследственных заболеваний у человека.

Основные принципы ДНК-диагностики:

Комплементарность азотистых оснований нуклеиновых кислот. Денатурация нуклеиновых кислот при нагревании. Ренатурация нуклеиновых кислот в соответствии с принципом комплементарности.

Гидролиз нуклеиновых кислот может быть достигнут с использованием специфических бактериальных ферментов – рестриктаз.

Фрагменты ДНК обладают электрофоретической подвижностью в агарозных и полиакриламидных гелях под действием электрического тока. Положение фрагмента в геле при прочих равных условиях определяется его молекулярной массой

Основные этапы ДНК-диагностики:

-сбор материала

-накопление (синтез) анализируемого продукта

-визуализация и интерпретация результатов

Идентификация известных/неизвестных мутаций

Прямая диагностика: мутации определенного гена Косвенная (непрямая) диагностика: семейный анализ различных

полиморфных вариантов ДНК, сцепленных с предполагаемым геном заболевания

Методы диагностики неизвестных мутаций в гене:

SSCP-анализ: ПЦР продукты денатурируют, быстро охлаждают и разгоняют в неденатурирующем геле.

Любые изменения в последовательности ДНК ведут к появлению различных конформаций, дающих в итоге различную подвижность цепей.

Окраска геля нитратом серебра или Syber Gold.

Гетеродуплексный анализ: Контрольную ДНК с известным гомозиготным генотипом смешивают с тестируемой ДНК.

ПЦР продукты денатурируют и медленно охлаждают.

При ренатурации образуются как полностью комплементарные цепи (нормальные или мутантные), так и гетеромерные, имееющие единичные расхождения в последовательности.

При анализе на геле, гетродуплексные последовательности показывают аномальную подвижность.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов: амплификация, рестрикция, гель-электрофорез

ДЛЯ ПОДТВЕРЖЕНИЯ МУТАЦИИ НЕОБХОДИМО СЕКВЕНИРОВАНИЕ

53. Детекция крупных перестроек ДНК на примере ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна.

Гибридизационную детекцию крупных ДНК-перестроек (делеций или дупликаций) можно рассмотреть на примере дистрофии Дюшена. Кодирующая часть гена дистрофина длиной 14 кБ, условно подразделенная начиная с 5’-конца гена, на субфрагменты размером 1 Кб, была получена в виде 9 отдельных клонов: 1-2, 3, 4-5b, 6а-7, 8, 9-10, 11а-12b, 13 и 14. Каждый из клонов может быть использован в качестве зонда для ДНКисследований. В приводимом примере в Hind III-рестрицированной ДНК больного блот-гибридизацией с зондом кДНК 8 выявлено отсутсвие отдельных фрагментов, соответствующих центральной области гена. Наличие делеций устанавливается по отсутствию соответствующих продуктов амплификации при электрофоретическом анализе амплификатов.

54. Детекция точечных мутаций методами рестрикционного анализа (серповидно-клеточная анемия) и аллель-специфичной гибридизации (фенилкетонурия)

Прямая детекция мутаций возможна и для нуклеотидных мутаций ДНК, изменяющих сайты узнавания соответвующих рестриктаз. При серповидноклеточной анемии, вследствие мутационной замены в 6ом кодоне гена бета-глобина аденина на тимин, нормальная нуклеотидная последовательность, узнаваемая ферментом Mst II, изменена на последовательность, уже не распознаваемую им. Т.о. при блот-