ВИКОРИСТАННЯ РАДІОАКТИВНИХ ІЗОТОПІВ У НАУЦІ Й ТЕХНІЦІ

Радіоактивні ізотопи різних хімічних елементів, одержаних штучно, широко застосовуються в різноманітних галузях народного господарства. Про використання радіоактивних ізотопів лише в одній якійсь галузі, наприклад харчовій промисловості чи медицині, написані великі книги. Спробуємо з'ясувати фізичні принципи найважливіших методів застосування радіоактивних ізотопів.

Основою практичного використання радіоактивних ізотопів є такі їх властивості:

а) будь-який радіоактивний ізотоп є міченим атомом відповідного хімічного елемента, тобто атомом, який за своїми фізичними і хімічними властивостями поводиться так само, як і звичайний атом, але за поведінкою якого можна спостерігати за його радіоактивним промінням;

б) будь-яке радіоактивне проміння має певну проникаючу здатність, тобто властивість поширюватися і поглинатися в даному середовищі певним чином;

в) радіоактивне проміння, проходячи крізь речовини, йонізує їх;

г) під дією нейтронів та інших випромінювань великої енергії в речовині утворюється наведена радіоактивність.

Відповідно до цих властивостей основні методи використання радіоактивного проміння можна розділити на такі чотири групи: а) мічені атоми (або радіоактивні індикатори); б) використання проникаючої здатності випромінювань; в) використання йонізуючої здатності випромінювань; г) використання різних форм наведеної радіоактивності.

Наведемо приклади застосування цих методів.

Метод мічених атомів полягає в тому, що до досліджуваного хімічного елемента домішується певна кількість його радіоактивного ізотопу. Цю радіоактивну домішку не можна хімічно відрізнити від основної маси елемента, однак її можна виявити за допомогою лічильника Гейгера — Мюллера чи іншого реєстратора радіоактивного проміння. Спостерігаючи за поведінкою радіоактивного ізотопу, можна судити і про поведінку хімічного елемента, який нас цікавить. Радіоактивність є своєрідною міткою, яка дає можливість стежити за поведінкою атомів того чи іншого хімічного елемента.

Використання мічених атомів дало можливість дістати дуже цінні відомості з біології, хімії, металургії, медицини, фізіології тощо. Наприклад, за допомогою мічених атомів можна дістати інформацію про швидкість обміну речовин в

Не менш широке застосування приладів, в яких використовується проникаюча здатність гамма- (рідше бета-) променів. В основу дії майже всіх цих приладів покладено один і той самий простий принцип: лічба в приймачі радіоактивних випромінювань детектора змінюється, якщо змінюється товщина або вид матеріалу між приймачем і джерелом випромінювання. На основі цього принципу діють різні прилади для вимірювання товщини виробу, густини речовини, рівня рідин чи сипких тіл у закритих посудинах, лічильники предметів, гамма-дефектоскопи та багато інших приладів. На цьому ж принципі діють також численні гамма-релейні пристрої, які автоматично контролюють хід виробничих процесів.

Однією з найбільш розвинутих галузей застосування радіоізотопних приладів цього типу є автоматичний контроль рівня рідких і сипких речовин у закритих непрозорих

посудинах, розплавленого чавуну в вагранках тощо. Принцип дії найбільш поширених приладів для контролю рівня є таким. З протилежних боків посудини один проти одного розміщують джерело (І) і приймач (2) випромінювання (мал. 159). Оскільки густина повітря значно менша за густину речовини, яка заповнює посудину 3, то поки рівень речовини знаходиться нижче від прямої, яка з'єднує джерело і приймач, потік випромінювання, пройшовши крізь стінки посудини, потрапляє на приймач. Якщо при заповненні посудини речовиною рівень останньої підніметься вище за пряму джерело — приймач, потік випромінювання не потрапляє на приймач, і спеціальний релейний пристрій вмикає світлову чи звукову сигналізацію або механізм автоматичного ре­гулювання рівня.

Важливим у народному господарстві є використання йонізуючої здатності радіоактивних випромінювань. Особливо в медицині для руйнування злоякісних пухлин. Під дією

пухлини, виліковується рак крові людини (лейкемія).

Радіоактивні випромінювання вбивають мікроорганізми, а тому застосовуються для стерилізації харчових продуктів і фармацевтичних препаратів. перетворюються в радіоактивні. Встановивши за характером випромінювання (за видом випромінюваних частинок, їх енергією і періодом піврозпаду), які саме радіоактивні ізотопи утворилися, можна судити про наявність у даній речовині домішок тих чи інших елементів. Чудовою особливістю активаційного аналізу є можливість виявлення дуже малих концентрацій досліджуваних елементів — до 10 -10 %.

Дуже цікавим прикладом використання явища наведеної радіоактивності є визначення віку археологічних об'єктів за

Ми, звичайно, розглянули далеко не всі можливі випадки застосування радіоактивних ізотопів у народному господарстві.

На закінчення розглянемо використання явища наведеної радіоактивності. Особливо широко це явище використовується в так званому активаційному аналізі. Якщо досліджувану речовину опромінити нейтронами, деякі з атомів стабільних ізотопів даної речовини, захопивши нейтрони,

Вплив радіації на організм людини, генетичні наслідки

Біологія

Основну частину опромінення населення земної кулі одержує відприродних джерел радіації. Більшість з них такі, що уникнутиопромінення від них зовсім неможливо. Протягом всієї історіїіснування Землі різні види випромінювання падають на поверхню Землі зкосмосу і надходять від радіоактивних речовин, що знаходяться в земній корі.

Людина піддається опроміненню двома способами. Радіоактивні речовиниможуть знаходитися поза організмом і опромінювати його зовні; в цьому випадкуговорять про зовнішнє опромінення. Або ж вони можуть опинитися в повітрі, якимдихає людина, в їжі або у воді і потрапити всередину організму. Такий спосібопромінення називають внутрішнім. Опромінення від природних джерелрадіації піддається будь-який житель Землі, проте одні з них одержуютьбільші дози, ніж інші. Це залежить, зокрема, від того, де вони живуть.

Рівень радіації в деяких місцях земної кулі, там, де залягаютьособливо радіоактивні породи, виявляється значно вище середнього, а вінших місцях - відповідно нижче. Доза опромінення залежить також від способужиття людей. Застосування деяких будівельних матеріалів, використаннягазу для приготування їжі, відкритих вугільних жаровень, герметизаціяприміщень і навіть польоти на літаках все це збільшує рівень опроміненняза рахунок природних джерел радіації. Земні джерела радіації в сумівідповідальні за більшу частину опромінення, якому піддається людина зарахунок природної радіації. У середньому вони забезпечують понад 5/6ефективної річної еквівалентної дози, одержуваної населенням, в основномувнаслідок внутрішнього опромінення. Іншу частину вносять космічні промені,головним чином шляхом зовнішнього опромінення. У цій главі ми розглянемоспочатку дані про зовнішнє опромінення від джерел космічного та земногопоходження. Потім зупинимося на внутрішнє опромінення, причому особливаувагу приділимо радіоактивного газу радону, який вносить найбільшийвнесок у середню дозу опромінення населення з усіх джерел природноїрадіації. Нарешті, в ній будуть розглянуті деякі сторони діяльностіособи, в тому числі використання вугілля і добрив, які сприяютьвилучення радіоактивних речовин із земної кори і збільшують рівеньопромінення людей від природних джерел радіації.

У результаті впливу іонізуючого випромінювання на організмлюдини в тканинах можуть відбуватися складні фізичні, хімічні табіохімічні процеси.

При потрапляння радіоактивних речовин всередину організму вражаючедію роблять в основному альфа-джерела, а потім ібета-джерела, тобто в зворотній зовнішньому опроміненнюпослідовності. Альфа-частинки, що мають невелику щільність іонізації,руйнують слизову оболонку, що є слабким захистомвнутрішніх органів у порівнянні із зовнішнім шкіряним покривом.

Існує три шляхи надходження радіоактивних речовин в організм: привдихання повітря, забрудненого радіоактивними речовинами, череззаражену їжу або воду, через шкіру, а також при зараженні відкритих ран.

Найбільш небезпечний перший шлях, оскільки по-перше, обсяг легеневоївентиляції дуже великий, а по-друге, значення коефіцієнта засвоєння влегенях більш високі.

Пилові частки, на яких сорбованих радіоактивні ізотопи, привдиханні повітря через верхні дихальні шляхи частково осідають в порожнинірота і носоглотки. Звідси пил надходить у травний тракт.

Інші частки надходять у легені. Ступінь затримки аерозолів у легенях залежить від їх дисперсійні. У легенях затримується близько 20% всіхчасток; при зменшенні розмірів аерозолів величина затримки збільшуєтьсядо 70%.

При всмоктуванні радіоактивних речовин зі шлунково-кишкового трактумає значення коефіцієнт резорбції, що характеризує частку речовини,попадає зі шлунково-кишкового тракту в кров. Залежно відприроди ізотопу коефіцієнт змінюється в широких межах: від сотих частоквідсотка (для цирконію, ніобію), до декількох десятків відсотків (водень, лучно-земельні елементи). Резорбція через непошкоджену шкіру в 200-300разів менше, ніж через шлунково-кишковий тракт, і, як правило, не граєістотної ролі.

При попаданні радіоактивних речовин в організм будь-яким шляхом вони вжечерез кілька хвилин виявляються в крові. Якщо надходженнярадіоактивних речовин було одноразовим, то концентрація їх у кровіспочатку зростає до максимуму, а потім протягом 15-20 дібзнижується.

Концентрації в крові довго живучих ізотопів надалі можутьутримуватися практично на одному рівні протягом тривалого часувнаслідок зворотного вимивання речовин, що відклалися. Ефектвпливу іонізуючого випромінювання на клітину - результат взаємопов'язанихкомплексних і взаємообумовлених перетворень. За А.М. Кузін,радіаційне ураження клітини здійснюється в три етапи. На першому етапівипромінювання впливає на складні макромолекулярні освіти, іонізіруяі збуджуючи їх. Це фізична стадія променевого впливу. Другий етап

- хімічні перетворення. Вони відповідають процесамвзаємодії радикалів білків, нуклеїнових кислот та ліпідів з водою,киснем, радикалами води і виникнення органічних перекисів.

Радикали, що виникають у шарах впорядковано розташованих білковихмолекул, що взаємодіють з утворенням "зшивок", в результаті чогопорушується структура біомембран. Через пошкодження лізосомальнихмембран відбувається збільшення активності та вивільнення ферментів,які шляхом дифузії досягають будь-якої органели клітини і легко в неїпроникають, викликаючи її лізис.

Кінцевий ефект опромінення є результатом не тількипервинного ушкодження клітин, але і наступних процесіввідновлення. Передбачається, що значна частина первиннихушкоджень у клітці виникає у вигляді так званих потенційнихпошкоджень, які можуть реалізовуватися у випадку відсутностівідновних процесів. Реалізація цих процесів сприяютьпроцеси біосинтезу білків і нуклеїнових кислот. Поки реалізаціяпотенційних ушкоджень не відбулася, клітка може в них

"відновитися". Це, як передбачається, пов'язане з ферментативнимиреакціями й обумовлено енергетичним обміном. Вважається, що воснові цього явища лежить діяльність систем, які у звичайнихумовах регулюють інтенсивність природного мутаційного процесу.

Мутагенний вплив іонізуючого випромінювання вперше встановилиросійські вчені Р.А. Надсон і Р.С. Філіппов у 1925 році в дослідах надріжджах. У 1927 році це відкриття було підтверджено Р. Меллером накласичному генетичному об'єкті - дрозофілі.

Іонізуючі випромінювання здатні викликати усі види спадкоємнихзмін. Спектр мутацій, індукованих опроміненням, не відрізняється відспектра спонтанних мутацій.

Останні дослідження Київського Інституту нейрохірургії показали, щорадіація навіть у малих кількостях, при дозах у десятки бер, найсильнішимчином впливає на нервові клітини - нейрони. Але нейрони гинуть не відпрямого впливу радіації. Як з'ясувалося, у результаті впливурадіації в більшості ліквідаторів ЧАЕС спостерігається "послерадіаціоннаяенцефлопатія ". Загальні порушення в організмі під дією радіації приводитьдо зміни обміну речовин, які спричиняють патологічнізміни головного мозку.

У своїй останній доповіді НКДАР ООН вперше за 20 років опублікувавдетальний огляд відомостей, що відносяться до гострого ураження організмулюдини, яке відбувається при великих дозах опромінення. Взагалі кажучи,радіація робить подібну дію, лише починаючи з деякою мінімальною,або «порогової», дози опромінення. Велика кількість відомостей було отриманопри аналізі результатів застосування променевої терапії для лікування раку.

Багаторічний досвід дозволив медикам отримати велику інформацію про реакціютканин людини на опромінення. Ця реакція для різних органів і тканинвиявилася неоднаковою, причому розходження дуже великі. Величина ж дози,визначає тяжкість ураження організму, залежить від того, чи отримує їїорганізм відразу або в декілька прийомів. Більшість органів встигає в тійабо іншій мірі залікувати радіаційні пошкодження і тому кращепереносять серію дрібних доз, ніж ту саму сумарну дозу опромінення,отриману за один прийом. Зрозуміло, якщо доза опромінення доситьвелика, опромінений людина загине. У всякому разі, дуже великі дозиопромінення близько 100 Гр. викликають настільки серйозне поразкицентральної нервової системи, що смерть, як правило, настає протягомдекількох годин або днів. При дозах опромінення від 10 до 50 Гр. при опроміненнівсього тіла ураження центральної нервової системи може виявитися не настільки серйозним, щобпризвести до летального результату, проте опромінений людина, скоріше за все всіодно помре через один-два тижні від крововиливів у шлунково-кишковомутракті. При ще менших дозах може не відбутися серйозних ушкодженьшлунково-кишкового тракту або організм з ними впорається, і, тим не менше,смерть може настати через один-два місяці з моменту опромінення головнимчином через руйнування клітин червоного кісткового мозку головного компонентакровотворної системи організму: від дози у 3 - 5 Гр. при опроміненні всьоготіла вмирає приблизно половина всіх опромінених. Таким чином, у цьомудіапазоні доз опромінення великі дози відрізняються від менших лише тим, щосмерть у першому випадку наступає раніше, а в другому пізніше. Зрозуміло,найчастіше людина помирає у результаті одночасної дії всіхвказаних наслідків опромінення. Дослідження в цій галузі необхідні,оскільки отримані дані потрібні для оцінки наслідків ядерної війни ідії великих доз опромінення при аваріях ядерних установок і пристроїв.

Червоний кістковий мозок та інші елементи кровотворної системи найбільшуразливі при опроміненні та втрачає здатність нормально функціонувати вжепри дозах опромінення 0,5 1 Гр. На щастя, вони володіють також чудовоюздатністю до регенерації, і якщо доза опромінення не настільки велика,щоб викликати пошкодження всіх клітин, кровотворна система може повністювідновити свої функції. Якщо ж опроміненню піддалося не все тіло, аякась його частина, то уцілілих клітин мозку буває достатньо для повноговідшкодування ушкоджених клітин. Репродуктивні органи і очі такожвідрізняються підвищеною чутливістю до опромінення. Одноразове опроміненнясім'яників при дозі всього лише в 0,1 Гр. призводить до тимчасової стерильностічоловіків, а дози понад дві греев можуть призвести до постійної стерильності:лише через багато років насінники зможуть знову продукувати повноціннусперму. Мабуть, насінники є єдиним винятком із загальногоправила: сумарна доза опромінення, отримана в декілька прийомів, для нихбільше, а не менш небезпечна, ніж та ж доза, отримана за один прийом. Яєчникинабагато менш чутливі до дії радіації, по крайней мере, удорослих жінок. Але одноразова доза> 3 Гр. все ж таки призводить до їхстерильності, хоча ще більші дози при опроміненні дробному ніяк непозначаються на здатності до дітородіння. Найбільш вразливою для радіаціїчастиною ока є кришталик. Загиблі клітини стають непрозорими,а розростання помутнілих ділянок призводить спочатку до катаракти, а потім ідо повної сліпоти. Чим більше доза, тим більше втрата зору. Помутніліділянки можуть утворитися при дозах опромінення 2 Гр. і менше. Більш важкаформа ураження очі прогресуюча катаракта спостерігається при дозах близько

5 Гр. Показано, що навіть пов'язане з рядом робіт професійне опроміненняшкідливо для очей: дози від 0,5 до 2 Гр., отримані протягом 10 20 років,призводять до збільшення щільності та помутніння кришталика. Діти також украйчутливі до дії радіації. Відносно невеликі дози приопроміненні хрящової тканини можуть сповільнити або зовсім зупинити в них зростаннякісток, що призводить до аномалій розвитку скелета. Чим менше вікдитини, тим сильніше пригнічується ріст кісток. Сумарної дози близько 10

Гр., Отриманої протягом кількох тижнів при щоденному опроміненні,буває достатньо, щоб викликати деякі аномалії розвитку скелета. За -Очевидно, для такої дії радіації не існує ніякого пороговогоефекту. Виявилося також, що опромінення мозку дитини при променевій терапіїможе викликати зміни в його характері, призвести до втрати пам'яті, а улюдини здатні витримувати набагато більші дози. Вкрай чутливий додії радіації і мозок плоду, особливо якщо мати піддається опроміненнюміж восьмий і п'ятнадцятий тижнями вагітності. У цей період у плодаформується кора головного мозку, і існує великий ризик того, що врезультаті опромінення матері (наприклад, рентгенівськими променями) народитьсярозумово відсталий дитина. Саме таким чином постраждали приблизно 30дітей, опромінених у період внутрішньоутробного розвитку під час атомнихбомбардувань Хіросіми і Нагасакі. Хоча індивідуальний ризик при цьомувеликий, а наслідки доставляють особливо багато страждань, число жінок,що знаходяться на цій стадії вагітності, в будь-який момент часу складаєлише невелику частину всього населення. Це, однак, найбільш серйозний засвоїми наслідками ефект з усіх відомих ефектів опромінення плодулюдини, хоча після опромінення плодів і ембріонів тварин в період їхвнутрішньоутробного розвитку було виявлено чимало інших серйознихнаслідків, включаючи порок і розвитку, недорозвиненість і летальний результат.

Більшість тканин дорослої людини відносно мало чутливі додії радіації. Нирки витримують сумарну дозу близько 23 Гр.,отриману протягом п'яти тижнів, без особливої шкоди для себе, печінка, защонайменше, 40 Гр. за місяць, сечовий міхур, щонайменше, 55 Гр. зачотири тижні, а зріла хрящова тканина до 70 Гр. Легкі надзвичайно складнийорган набагато більш уразливі, а в кровоносних судинах незначні, але,можливо, істотні зміни можуть відбуватися вже при відносноневеликих дозах. Звичайно, опромінення в терапевтичних дозах, як і всякеінше опромінення, може викликати захворювання на рак в майбутньому або призвести донесприятливим генетичним наслідків. Опромінення в терапевтичнихдозах, однак, звичайно застосовують для лікування раку, коли людинасмертельно хворий, а оскільки пацієнти в середньому досить літні люди,ймовірність того, що вони будуть мати дітей, також відносно мала.

Однак далеко не так просто оцінити, наскільки великий цей ризик при набагатоменших дозах опромінення, які люди отримують в своєму повсякденному житті іна роботі, і із цього приводу існують різні думки середгромадськості.

Рак найбільш серйозне з усіх наслідків опромінення людини прималих дозах, принаймні, безпосередньо для тих людей, якіпіддалися опроміненню. Справді, великі обстеження, які охопилиблизько 100 000 осіб, які пережили атомні бомбардування Хіросіми і Нагасаків 1945 році, показали, що поки рак є єдиною причиноюпідвищеної смертності в цій групі населення. Оцінки НКДАР ООН ризикузахворювання на рак в значній мірі спираються на результати обстеженнялюдей, які пережили атомне бомбардування. Комітет використовує й іншіматеріали, у тому числі відомості про частоту захворювання раком серед жителівостровів у Тихому океані, на яких відбулося випадання радіоактивнихопадів після ядерних випробувань у 1954 році, серед робітників урановихрудників і серед осіб, що пройшли курс променевої терапії. Але матеріали з

Хіросімі та Нагасакі це єдине джерело відомостей, що відображаєрезультати ретельного обстеження протягом більше 30 років численноїгрупи людей різного віку, які зазнали більш-меншрівномірному опромінення всього тіла. Незважаючи на всі ці дослідження, оцінкаймовірності захворювання людей на рак в результаті опромінення не цілкомнадійна. Є маса корисних відомостей, отриманих при експериментах натварин, однак, незважаючи на їх очевидну користь, вони не можуть повноюмірою замінити відомостей про дію радіації на людину. Для того щобоцінка ризику захворювання на рак для людини була досить надійна,отримані в результаті обстеження людей відомості повинні задовольнятицілого ряду умов. Повинна бути відома величина поглиненої дози.

Випромінювання має рівномірно потрапляти на все тіло або, принаймні, нату його частину, яка вивчається в даний момент. Опромінене населеннядолжно проходити обстеження регулярно протягом десятиліть, щоб встиглипроявитися всі види ракових захворювань Діагностика повинна бути достатньоякісною, що дозволяє виявити всі випадки ракових захворювань. Дужеважливо також мати хорошу «контрольну» групу людей, яку можна порівняти у всіхвідносинах (крім самого факту опромінення) з групою осіб, за якою ведетьсяспостереження, щоб з'ясувати частоту захворювання раком у відсутністьопромінення. І обидві ці популяції повинні бути досить численні, щоботримані дані були статистично достовірні. Жоден із наявнихматеріалів не повністю задовольняє всім цим вимогам. Ще більшепринципова невизначеність полягає в тому, що майже всі дані прочастоті захворювання на рак в результаті опромінення отримані при обстеженнілюдей, що отримали відносно великі дози опромінення 1 Гр. і більше.

Є дуже небагато відомостей про наслідки опромінення при дозах,пов'язаних з деякими професіями, і зовсім відсутні прямі дані продії доз опромінення, одержуваних населенням Землі в повсякденному житті.

Тому немає ніякої альтернативи такому способу оцінки ризику населення прималих дозах опромінення, як екстраполяція оцінок ризику при великих дозах

(вже не цілком надійних) в область малих доз опромінення НКДАР ООН, так само якта інші установи, що займаються дослідженнями в цій області, у своїхоцінках спирається на два основні допущення, які поки що цілкомузгоджуються з усіма наявними даними. Згідно з першим допущенню, неіснує ніякої порогової дози, за якої відсутній ризик захворюванняраком. Будь-яка як завгодно мала доза збільшує ймовірність захворюваннярак для людини, яка отримала цю дозу, і будь-яка додаткова дозаопромінення ще більш збільшує цю вірогідність. Друге допущенняполягає в тому, що ймовірність, або ризик, захворювання зростає прямопропорційно до дози опромінення: при подвоєння дози ризик подвоюється, приотриманні триразовою дози потроюється і т. д. НКДАР вважає, що притакому допущенні можлива переоцінка ризику в області малих доз, але навряд чиможлива його недооцінка. На такий свідомо недосконалої, але зручною основіі будуються всі приблизні оцінки ризику захворювання різними видамираку при опроміненні. Згідно з наявними даними, першими в групі раковихзахворювань, що вражають населення в результаті опромінення, стоять лейкози.

Вони викликають загибель людей в середньому через 10 років з моменту опроміненнянабагато раніше, ніж інші види ракових захворювань. Смертність від лейкозівсеред тих, хто пережив атомні бомбардування Хіросіми і Нагасакі, сталарізко знижуватися після 1970 року; мабуть, данина лейкозу в цьому випадкусплачено майже повністю. Таким чином, оцінка ймовірності померти відлейкозу в результаті опромінення більш надійна, ніж аналогічні оцінки дляінших видів ракових захворювань. Згідно з оцінками НКДАР ООН, від кожноїдози опромінення в 1 Гр. в середньому дві людини з тисячі помруть від лейкозів.

Інакше кажучи, якщо хто-небудь отримає дозу 1 Гр. при опроміненні всього тіла,при якому страждають клітини червоного кісткового мозку, то існує однашанс із 500, що ця людина помре надалі від лейкозу. Самимипоширеними видами раку, викликаними дією радіації, виявилися ракмолочної залози та рак щитовидної залози. За оцінками НКДАР, приблизно удесяти чоловік з тисячі опромінених відзначається рак щитовидної залози, а удесяти жінок з тисячі рак молочної залози (у розрахунку на кожний грейіндивідуальної поглиненої дози). Однак обидва різновиди раку в принципівиліковні, а смертність від раку щитовидної залози особливо низька. Томулише п'ять жінок з тисячі, мабуть, помруть від раку молочної залози накожний грей опромінення і лише одна людина з тисячі опромінених, по -мабуть, помре від раку щитовидної залози. Рак легенів, навпаки,нещадний вбивця. Він теж належить до поширених різновидівракових захворювань серед опромінених груп населення. На додаток до данихобстеження осіб, які пережили атомні бомбардування Хіросіми і Нагасакі,були отримані відомості про частоту захворювання раком легенів серед шахтарівуранових рудників у Канаді, Чехословаччині та США. Цікаво, однак, щооцінки, отримані в обох випадках, значно розходяться: навіть беручидо уваги різний характер опромінення, ймовірність захворіти на рак легенів накожну одиницю дози опромінення для шахтарів уранових рудників опинилася в 4

7 разів вище, ніж для людей, які пережили атомне бомбардування. НКДАРрозглянув кілька можливих причин такої розбіжності, серед яких неостанню роль відіграє той факт, що шахтарі в середньому старші, ніж населенняяпонських міст в момент опромінення. Згідно з поточними оцінками комітету, згрупи людей в тисячу чоловік, вік яких у момент опромінення перевищує

35 років, мабуть, п'ятеро людей помруть від раку легенів у розрахунку на кожнийгрей середньої індивідуальної дози опромінення, але лише половина цьогокількості у групі, що складається з представників будь-якого віку. Цифра

«П'ять» це нижня оцінка смертності від раку легенів серед шахтарів урановихрудників. Рак інших органів і тканин, як виявилося, зустрічається середопромінених груп населення рідше. Згідно з оцінками НКДАР, ймовірністьпомерти від раку шлунка, печінки або товстої кишки складає приблизно за вселише 1/1000 на кожний грей середньої індивідуальної дози опромінення, а ризиквиникнення раку кісткових тканин, стравоходу, тонкої кишки, сечового міхура,підшлункової залози, прямої кишки і лімфатичних тканин ще менше іскладає приблизно від 0,2 до 0,5 на кожну тисячу і на кожний грей середньоїіндивідуальної дози опромінення. Діти більш чутливі до опромінення, ніждорослі, а при опроміненні плоду ризик захворювання на рак, мабуть, щебільше. У деяких роботах дійсно повідомлялося, що дитячасмертність від раку більше серед тих дітей, матері яких у періодвагітності піддалися впливу рентгенівських променів, проте НКДАР покине переконаний, що причина встановлена вірно. Серед дітей, облуплених вперіод внутрішньоутробного розвитку в Хіросімі та Нагасакі, також поки невиявлено підвищеної схильності до захворювання на рак. Взагалі кажучи,є ще ряд розбіжностей між даними з Японії та іншими джерелами.

Крім зазначених вище протиріч в оцінці ризику захворювання на рак легеньє значні розбіжності, як по раку молочної залози, так і зараку щитовидної залози. І в тому і в іншому випадку дані з Японії даютьзначно нижчу частоту захворювання на рак, ніж інші джерела; вобох випадках НКДАР прийняв як оцінки великі значення. Зазначеніпротиріччя зайвий раз підкреслюють труднощі отримання оцінок в областімалих доз на підставі відомостей, що відносяться до великих доз і отриманихз дуже обмеженої кількості джерел. Складність отримання більш -менш надійних оцінок ризику ще більше зростає через невизначеність воцінці доз, які були отримані людьми, які пережили атомнубомбардування. Нові відомості з інших джерел фактично поставили підсумнів правильність попередніх розрахунків поглинених доз в Японії, і всі вонизараз перевіряються заново. Оскільки отримання оцінок пов'язаноз такими труднощами, то не дивно, що немає єдиної думки з питання проте, наскільки великий ризик захворювання на рак при малих дозах опромінення. Уцій галузі необхідні подальші дослідження. Особливо корисно було бпровести обстеження людей, які отримують дози, характерні для рядупрофесій і умов навколишнього середовища. На жаль, чим менше доза, тимважче одержати статистично достовірний результат. Підраховано, наприклад,що якщо оцінки НКДАР більш-менш вірні, то при визначенні частотзахворювання за всіма видами раку серед персоналу підприємств ядерногопаливного циклу, які отримують індивідуальну середню дозу близько 0,01 Гр. врік, для отримання значущого результату буде потрібно кілька мільйонівроків. А отримати значущий результат при обстеженні людей, на якихдіє лише радіаційний фон від навколишнього середовища, було б набагатоважче. Є ряд питань ще складніших, що вимагають вивчення.

Радіація, наприклад, може в принципі надавати дію на різніхімічні та біологічні агенти, що може приводити в якихось випадках дододаткового збільшення частоти захворювання на рак, очевидно, що цейпитання надзвичайно важливе, тому що радіація присутня всюди, а всучасного життя багато різноманітних агентів, які можуть з неювзаємодіяти. НКДАР ООН провів попередній аналіз даних,охоплює велике число таких агентів. Щодо деяких з нихвиникли деякі підозри, але серйозні докази були отриманітільки для одного з них: тютюнового диму. Виявилося, що шахтарі урановихрудників з числа тих, що палять захворюють на рак набагато раніше (рис. 5.6). Уінших випадках даних явно недостатньо, і необхідні подальшідослідження. Давно висловлювалися припущення, що опромінення, можливо,прискорює процес старіння і таким чином зменшує тривалістьжиття. НКДАР ООН розглянула недавно всі дані на користь такої гіпотези, алене виявив досить переконливих доказів, які підтверджують її, якдля людини, так і для тварин, принаймні при помірних і малихдозах, одержуваних при хронічному опроміненні. Опромінені групи людейдійсно мають меншу тривалість життя, але у всіх відомихвипадках це цілком пояснюється більшою частотою ракових захворювань.

Вивчення генетичних наслідків опромінення зв'язано з ще більшимитруднощами, ніж у випадку раку. По-перше, дуже мало відомо про те,які ушкодження виникають у генетичному апараті людини при опроміненні;по-друге, повне виявлення всіх спадкоємних дефектів відбувається лише протягом багатьох поколінь, і, по-третє, як і у випадку раку, цідефекти неможливо відрізнити від тих, які виникли зовсім з іншихпричин. Близько 10% усіх живих немовлят мають ті або інші генетичнідефекти, починаючи від необтяжливих фізичних недоліків типудальтонізму і кінчаючи такими важкими станами, як синдром Дауна, хорея

Гентінгтона і різні вади розвитку. Багато хто з ембріонів і плодів зважкими спадковими порушеннями не доживають до народження; згіднонаявними даними, близько половини всіх випадків спонтанного аборту пов'язані заномаліями в генетичному матеріалі. Але навіть якщо діти зі спадковимидефектами народжуються живими, імовірність для них дожити до свого першогодня народження в п'ять разів менше, ніж для нормальних дітей. Генетичніпорушення можна віднести до двох основних типів: хромосомні аберації,включають зміни числа або структури хромосом, і мутації в самих генах.

Генні мутації підрозділяються далі на домінантні (які виявляютьсявідразу в першому поколінні) і рецесивні (які можуть проявитися лише втому випадку, якщо в обох батьків мутантним є один і той самий ген;такі мутації можуть не проявитися протягом багатьох поколінь або невиявитися взагалі). Обидва типи аномалій можуть привести до наследствсннимзахворювань у наступних поколіннях, а можуть і не проявитися взагалі.

Оцінки НКДАР ООН стосуються лише випадків важкої спадкової патології.

Серед більш ніж 27 000 дітей, батьки яких отримали щодовеликі дози під час атомних бомбардувань Хіросіми і Нагасакі, буливиявлено лише дві ймовірні мутації, а серед приблизно такого ж числадітей, батьки яких отримали менші дози, не відзначено жодного такоговипадку. Серед дітей, батьки яких були опромінені в результаті вибухуатомної бомби, не було також виявлено статистично достовірного приростучастоти хромосомних аномалій. І хоча в матеріалах деяких обстеженьміститься висновок про те, що в опромінених батьків більше шансів народитидитини з синдромом Дауна, інші дослідження цього не підтверджують.

Трохи насторожує повідомлення про те, що у людей, які отримують малі дозиопромінення, дійсно спостерігається підвищений вміст клітин крові зхромосомними порушеннями. Цей феномен при надзвичайно низькому рівніопромінення був відзначений у жителів курортного містечку Бадгастайн в Австрії татам же серед медичного персоналу, що обслуговує радонові джерела зцілющими, як вважають, властивостями. Серед персоналу АЕС у ФРН,

Великобританії і США, який отримує дози, що не перевищують граничнодопустимого, згідно з міжнародними стандартами, рівня, також виявленіхромосомні аномалії. Але біологічне значення таких ушкоджень і їхвплив на здоров'я людини поки що не з'ясовані. Оскільки немає жодних іншихвідомостей, доводиться оцінювати ризик появи спадкових дефектів улюдини грунтуючись на результатах, отриманих у численнихекспериментах на тваринах. При оцінці ризику появи спадковихдефектів у людини НКДАР використовує два підходи. При одному підходінамагаються визначити безпосередній ефект даної дози опромінення, приіншому намагаються визначити дозу, при якій подвоюється частота появинащадків з тією чи іншою різновидом спадкових дефектів у порівнянніз нормальними радіаційними умовами. Згідно з оцінками, отриманими припершому підході, доза в 1 Гр., отримана при низькому рівні радіації тількиособинами чоловічої статі, індукує появу від 1000 до 2000 мутацій,приводять до серйозних наслідків, і від 30 до 1000 хромосомних абераційна кожен мільйон живих немовлят. Оцінки, отримані для особинжіночої статі, набагато менш визначені, але явно нижче; це пояснюєтьсятим, що жіночі статеві клітини менш чутливі до дії радіації.

Згідно з орієнтовними оцінками, частота мутацій становить від 0 до 900, ачастота хромосомних аберацій від 0 до 300 випадків на мільйон живихновонароджених. Згідно з оцінками, отриманими другим методом, хронічнеопромінення при потужності дози в 1 Гр. на покоління (для людини-30 років)призведе до появи близько 2000 серйозних випадків генетичних захворюваньна кожен мільйон живих немовлят серед дітей тих, хто піддався такомуопромінення. Цим методом користуються також для оцінки сумарної частотипояви серйозних спадкових дефектів у кожному поколінні за умови,що той же рівень радіації буде діяти весь час. Згідно з цимиоцінками, приблизно 15 000 живих новонароджених з кожного мільйона будутьнароджуватися із серйозними спадковими дефектами через таке радіаційногофону. Цей метод намагається врахувати вплив рецесивних мутацій. Про нихвідомо небагато, і з цього питання ще немає єдиної думки, але вважається,що їхній внесок у сумарну частоту появи спадкових захворюваньнезначний, оскільки мала ймовірність шлюбного союзу між партнерами змутацією в одному і тому ж гені. Небагато відомо також про вплив опроміненняна такі ознаки, як ріст і плодючість, які визначаються не одним,а багатьма генами, що функціонують у тісній взаємодії один з одним.

Оцінки НКДАР ООН належать переважно до дії радіації на одиничнігени, оскільки оцінити внесок таких полігенних чинників надзвичайно важко.

Ще великим недоліком оцінок є той факт, що обидва методи здатніреєструвати тільки серйозні генетичні наслідки навчання. Євагомі підстави вважати, що число не дуже істотних дефектівзначно перевищує число серйозних аномалій, так що наноситься ними збитокв сумі може бути навіть більше, ніж від серйозних дефектів. В останньомудоповіді НКДАР вперше була зроблена спроба оцінити збиток, що наноситьсясуспільству серйозними генетичними дефектами, всіма разом і кожним зокремаокремо. Наприклад, і синдром Дауна, і хорея Гентінгтона це серйознігенетичні захворювання, але соціальний збиток від них неоднаковий. Хорея

Гентінгтона вражає організм людини між 30 і 50 роками і викликаєдуже важку, але поступову дегенерацію центральної нервової системи;синдром Дауна виявляється в дуже важкому ураженні організму з самогонародження. Якщо намагатися якось диференціювати ці хвороби, то очевидно,що синдром Дауна слід розцінювати як хвороба, що завдають суспільствубільше шкоди, ніж хорея Гентінгтона. Таким чином НКДАР ООН спробуваввисловити генетичні наслідки опромінення через такі параметри, якскорочення тривалості життя і періоду працездатності. Ціпараметри, звичайно, не можуть дати а?? екватного уявлення про стражданняжертв спадкових недуг або такі речі, як відчай батьківхворої дитини, але до них і неможливо підходити з кількіснимимірками. Цілком віддаючи собі звіт в тому, що ці оцінки не більш ніжперша груба прикидка, НКДАР наводить у своїй останній доповіді наступніцифри: хронічне опромінення населення з потужністю дози 1 Гр. на поколінняскорочує період працездатності на 50000 років, а тривалість життятакож на 50000 років на кожен мільйон живих немовлят серед дітейпершого опроміненого покоління; ті ж параметри при постійному опроміненнібагатьох поколінь виходять на стаціонарний рівень: скорочення періодупрацездатності становитиме 340000 років, а скорочення тривалості життя

286 000 років на кожен мільйон живих немовлят. Незважаючи на своюприблизність, ці оцінки є все-таки необхідні, оскільки вони представляютьсобою спробу взяти до уваги соціально значимі цінності при оцінцірадіаційного ризику. А це такі цінності, які дедалі більшою міроювпливають на вирішення питання про те, прийнятний ризик в тому чи іншому випадку абонемає. І це можна тільки вітати.

Радіоактивні ізотопи і сполуки, мічені радіоактивними ізотопами, широко застосовуються в самих різних областях людської діяльності. Промисловість і технологічний контроль, сільське господарство і медицина, засоби зв'язку та наукові дослідження - охопити весь спектр застосування радіоактивних ізотопів практично неможливо, хоча всі вони виникли трохи більше, ніж за 100 років. Представлений нижче матеріал присвячений використанню радіоактивних ізотопів у різних молекулярно-біологічних дослідженнях і є навчально-методичним посібником, а не суворої науковою публікацією. На жаль, значна частина початківців молодих вчених, що працюють в області life science, уявляє собі специфіку робіт з радіоактивними речовинами поверхнево і фрагментарно. Це не дивно, тому що в Росії освіту на медичних і біологічних факультетах не дає ні основних теоретичних уявлень про радіоактивність, ні практичних навичок у цій області. У хіміків ситуація краща, тому що деякі основні поняття про природу радіоактивності входять у навчальну програму. Хоча представлений матеріал розрахований на малоподготовленной читача, сподіваюся, що він може виявитися корисним і для професіоналів. 1. Основні поняття і термінологія Радіоактивність (radioactivity) - це позначення дивного явища природи, відкритого Беккерелем в кінці XIX століття, суть якого полягає в мимовільному спонтанному перетворення атомних ядер деяких елементів в інші, яке супроводжується виділенням трьох видів "променів". Природу променів встановили швидко: α-промені - це двократно іонізовані атоми гелію, β-промені - це електрони, γ-промені - це жорстке короткохвильове електромагнітне випромінювання. Елементи, здатні до таких перетворень стали називатися радіоактивними, тобто здатними до цього перетворенню. Залежно від типу випромінювання, радіоактивні атоми стали визначати відповідно як α, β чи γ випромінювачі або джерела. Щоправда, невдовзі було встановлено, що деякі радіоактивні атоми випромінюють відразу два (а можливо, і три) виду променів, тому така класифікація доповнюється поясненнями - це "чистий" α-випромінювач або є супутнє γ-випромінювання. До початковою трьох типів ядерних перетворень (α, β і γ - радіоактивний розпад) додалися нові, проте, загальні закономірності для всіх залишилися незмінними. У кінці ХХ століття було рекомендовано термін "ізотоп" замінити на "нуклід" і, відповідно, "радіоактивний ізотоп" на "радіонуклід". Особливо широкого поширення це нововведення не отримало, і обидва терміни використовуються у науковій літературі як синоніми. Кількісна характеристика радіоактивності отримала у фізиків назва "активність" (activity). Так як фізикам ніхто не давав монопольного права на термін "активність", то з часом з'ясувалося, що в різних областях науки під "активністю" розуміють зовсім різні поняття. Порівняйте: активність радіоактивного ізотопу, хімічна активність елемента або сполуки, ензимологічні активність ферменту, біологічна (наприклад, антивірусна) активність препарату - все це абсолютно різні поняття. Зближення різних наукових дисциплін ще більше заплутує становище. Спробуйте охарактеризувати фермент, мічений радіоактивним ізотопом вуглецю-14. Активність такого ферменту - це його ензимологічні характеристика чи радіоактивна? Тому в сучасній науковій літературі (особливо біологічної) все частіше термін "активність" для радіоактивних речовин замінюється терміном "радіоактивність". За одиницю активності (радіоактивності) радіоактивної речовини в Міжнародній системі СІ прийнята швидкість радіоактивного розпаду, що дорівнює 1 розпаду в секунду, яка отримала назву бекерель - Бк (в англійській версії Bq). Застаріла, але як і раніше використовується одиниця активності кюрі - Кі (в англійській версії Ci) - це активність препарату, еквівалентна активності 1 г металевого радію-226 і рівна 3,7 х10 ¹⁰ розпадів у секунду, тобто 3,7 х10 ¹⁰ Бк. Строго кажучи, радіоактивний розпад - це перетворення ядра атома радіоактивного елемента, яке супроводжується виділенням продуктів такого перетворення. Наприклад, електронне захоплення являє собою поглинання електрона ядром з виділенням γ-кванта, і такий тип "радіоактивного розпаду" точніше слід називати "ядерним перетворенням". Втім, обидва терміни використовуються в літературі на рівних, незважаючи на перевагу "ядерного перетворення". Основний закон радіоактивного розпаду описується чудовою формулою: N _t = N ₀ ^e-λt де: N _t - кількість розпалися радіоактивних атомів; N ₀ - початкова кількість радіоактивних атомів; е - основа натурального логарифма; λ - константа швидкості радіоактивного розпаду; t - час. На практиці для роботи нею ніхто не користується, проте, з цієї формули слід відразу декілька досить простих, але дуже важливих висновків і наслідків, які треба знати всім працюючим з радіоактивними ізотопами: 1. Кількість радіоактивних атомів, які розпалися за деякий час спостереження, залежить тільки від їх початкової кількості і часу спостереження (розпаду). Ніякі інші параметри: астрономічні, фізичні, хімічні, парапсихологічні і "чарівні" на радіоактивний розпад не впливають. Константа швидкості радіоактивного розпаду [λ] (іноді її називають константою розпаду) визначається тільки природою ізотопу і для кожного ізотопу має свою величину. Всі спроби уповільнити радіоактивний розпад охолодженням (навіть у рідкому азоті) або прискорити розпад нагріванням абсолютно безглузді. Ви можете впливати на стабільність хімічної сполуки, змінюючи температуру його зберігання, але кількість радіоактивних атомів у препараті при цьому не зміниться. 2. Швидкість радіоактивного розпаду змінюється по експоненті (тобто нелінійно), і розраховувати кількість радіоактивного матеріалу в вашому препараті треба з урахуванням цього факту, користуючись або вищенаведеної формулою, або відповідними таблицями розпаду (що зазвичай і роблять на практиці). 3. Уявіть собі, що у формулі радіоактивного розпаду N _t = 1 / 2 N _0, тобто розпалася рівно половина радіоактивних атомів, що містяться в препараті. Час цього процесу - константа Т _{1 \ 2} - називається періодом напіврозпаду. Фізичний сенс - час, за який розпадається половина радіоактивних атомів даного ізотопу. Ця величина вельми корисна для працюючих з радіоактивністю, тому що дозволяє швидко оцінити "втрати на розпад" препарату. 4. Фізичний сенс константи швидкості радіоактивного розпаду [λ] - це активність 1 моля (або ммоля) 100% радіоактивного ізотопу і відповідно розмірність цієї константи - Бк / моль (Bq / mol) або Кі / ммоль (Ci / mmol). Тобто, це теоретично досяжна молярна активність (активність одного моля радіоактивної речовини), знання якої дозволяє оцінити чутливість методу і якість радіоактивного препарату. Нижче про це буде сказано докладніше. 2. Детекция і кількісні вимірювання радіонуклідів Детектування радіоактивного розпаду засноване на його різних фізичних властивостях: 5. здатність взаємодіяти з кристалами бромистого срібла, засвечівая світлочутливі матеріали, - авторадіографія, 6. здатність викликати "свічення" при зіткненні продуктів розпаду з деякими речовинами - сцинтилляция, 7. здатність іонізувати молекули навколишнього середовища продуктами радіоактивного розпаду - іонізація, 8. здатність викликати дефекти в кристалічних гратах, 9. здатність здійснювати (або каталізувати) деякі хімічні реакції. Всі ці здібності були задіяні при створенні різних вимірювальних приладів і індикаторів різного призначення. Однак, для вимірювання активності, тобто кількості ядерних перетворень в одиницю часу, найбільш широке розповсюдження отримали прилади, засновані на використанні сцинтиляції або іонізації. При цьому в life science використовують, як правило, сцинтиляційні прилади і авторадіографія, а для фізичних, інженерних та медичних робіт - прилади, що вимірюють іонізацію середовища. Втім, таке розділення вельми умовно, оскільки різноманітних приладів та засобів вимірювань було створено за 100 років дуже багато. Слід особливо виділити прилади для вимірювання іонізуючої здатності випромінювання. Це найважливіша складова контролю за опроміненням персоналу, що працює з джерелами іонізуючого випромінювання (у тому числі і з радіоактивними речовинами). Контроль за радіаційною обстановкою здійснюється за особливими правилами, і коротка інформація про норми радіаційної небезпеки і одиницях, в яких ці норми встановлені. Поки треба підкреслити, що активність радіоактивного препарату і радіаційна обстановка біля цього препарату - це зовсім різні характеристики, наприклад, як маса речовини та її твердість. Одиниці активності (Бк або Кі) говорять про кількість ядерних перетворень в одиницю часу. Найбільш популярна одиниця експозиційної дози для γ-(рентгенівського) випромінювання - рентген (Р) - говорить про величину потоку іонізуючого випромінювання (потоку енергії), що проходить через шар сухого повітря і викликає іонізацію певного числа молекул повітря. Тому жодного прямого зв'язку між цими величинами немає. Велика частина радіонуклідів, які використовуються в life science (про це нижче), взагалі ніяк не може бути охарактеризована терміном експозиційна доза, який введено для γ-(рентгенівського) випромінювання. 2.1. Авторадіографія Це історично самий перший і, як і раніше, дуже популярний метод детекції різних радіонуклідів. Головна перевага авторадіографії - простота і доступність. Витримайте (проекспоніруйте) зразок з рентгенівською плівкою, потім проявіть плівку в стандартних умовах - і отримаєте картину розподілу радіонукліда по поверхні зразка: гелю, тонкошарової хроматограми і т.д. Якщо отримана "картинка" вас не влаштовує - можна повторити експозицію з новою плівкою, збільшуючи (або зменшуючи) час за своїм бажанням. Зазвичай час експозиції змінюють у 2ч3 рази, так як зміна часу експозиції на 20ч30% суттєвих змін в картину не вносить. Весь сиквенсу ДНК і РНК з радіоактивним фосфором використовував виключно авторадіографія. Флюоресцентна мітка практично повністю витіснила радіоактивні ізотопи з секвенування, проте авторадіографія залишається широко застосовуваним методом детекції. Головний недолік авторадіографії - труднощі з кількісною оцінкою. При візуальному визначенні навіть інтуїтивно зрозуміло, що інтенсивність "почорніння" плівки пропорційна кількості радіоактивних атомів в цьому місці. Але питання про цю "пропорційності" має потребу в поясненні. Існує кілька типів сканерів, що дозволяють досить точно визначати інтенсивність "темна" плівки і, отже, порівнювати плями інструментально, а не "на око". Виявилося, що діапазон активності препарату, в якому інтенсивність "темна" плівки прямо пропорційна кількості радіоактивних атомів, дуже невеликий і залежить від часу експозиції зразка з плівкою, типу плівки, природи радіонукліда (тип розпаду та енергія випромінювання) і навіть від режиму обробки плівки. Наприклад, для фосфору-32 за ніч експозиції лінійна залежність "темна" плівки від активності зразка знаходиться в діапазоні 0,5 ч25 Бк на мм ² (приблизно 30ч1500 імп / хв). Подальше збільшення активності зразка, наприклад, до 100 Бк на мм ² не призводить до більшої інтенсивності "темна" - все вже "зашкалило". Тому, просту пораду для початківців працювати з кількісною авторадіографія. Зробіть кілька калібровок - нанесіть ряд плям діаметром 1ч1, 5 мм з активністю 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проекспоніруйте їх з рентгенівською плівкою різний час і після обробки плівки проскануйте її на своєму приладі. Ви відразу визначте діапазон, в якому ваші наступні кількісні вимірювання радіоавтографов будуть коректними. Для різних радіонуклідів такий діапазон різниться дуже істотно, але враховувати його треба в будь-якому випадку. Для збільшення чутливості авторадіографії (точніше, для зменшення часу експозиції) можна скористатися підсилюють екранами. Це досить ефективно для фосфору-32 або йоду-125, однак практично марно для м'яких (слабоенергетіческіх) β-випромінювачів. Використання екрану для фосфору-32 дозволяє знизити час експозиції в 2ч3 рази, але за це доводиться "платити" погіршенням дозволу, яке відбувається за рахунок "розмивання зон". 2.2. Сцинтиляційні лічильники Ефект сцинтиляції для кількісного визначення радіонуклідів починали використовувати ще за часів Резерфорда, який візуально вважав сцинтиляційні спалаху під мікроскопом. За сто років принципових змін не відбулося. Поруч із джерелом випромінювання поміщають сцинтилятор і ФЕУ (фотоелектронний помножувач), який вважає спалаху. Сцинтілятор може бути твердим, а може бути і рідким (частіше, розчиненим в рідині). У флакон (vial) з рідким сцинтилятором додають тестований зразок, і в цьому випадку можна ефективно вимірювати навіть саме "слабке", низькоенергетичне випромінювання. При вимірі активності (радіоактивності) будь-яких зразків і для будь-яких засобів вимірювання необхідно пам'ятати декілька простих, але важливих правил: 10. Радіоактивний розпад є класичним прикладом випадкового, імовірнісного природного процесу і, розглядаючи вимірювання активності як реєстрацію випадкових подій, ми отримуємо математичну помилку вимірювання активності: n ^{1 / 2 /} nx 100% де n - число "подій" (у нашому випадку розпадів) Наприклад, для 400 зареєстрованих імпульсів на будь-якому приладі незалежно від часу вимірювання (спостереження) 400 ^{1 / 2} / 400 х 100% = 5%, тобто помилка 5%. Це означає, що чим більше число вимірювань (власне рахунок), тим менше математична помилка вимірювання. Більше того, всупереч усталеної традиції, для зниження математичної помилки виміру треба вважати не кількість зареєстрованих приладом розпадів (імпульсів) за одиницю часу, а час, необхідне для "накопичення потрібного" числа імпульсів - наприклад, 10000 імп. Тим не менш, в усьому світі активність за допомогою лічильників вимірюють як кількість імпульсів за одиницю часу (звичайно по 1 хвилині). 11. Усі лічильники мають верхню межу вимірювання, після якого їх точність падає, так як лічильник не встигає реєструвати - "захлинається". Для сцинтиляційних лічильників - це активність на рівні ¹⁰ червня Ч10 ⁷ розп. / хв. Деякі типи лічильників мають вбудоване блокування і відмовляються вважати зразки, активність яких перевищує встановлену для даної моделі. Оптимальна активність зразка для точного вимірювання ¹⁰ квітня Ч10 ⁶ розп. / хв.

12. Проводячи кількісні вимірювання, наприклад, визначаючи концентрацію радіонукліду в розчині, завжди робіть хоча б 2, а краще 3 вимірювання незалежних аліквотах і активність визначайте як середню з 2 - 3 вимірювань. Витрати часу на "зайві" процедури будуть з лишком компенсовані відсіканням випадкових "викидів". Розкид у вимірах, особливо у початківців дослідників, може досягати 200% і більше, хоча в нормі не повинен перевищувати звичайну помилку рутинного відбору аліквотах. 13. Ні один вимірювальний прилад не реєструє 100% всіх "розпадів" (decompositions) у вимірюваному зразку. Ефективність рахунку - це коефіцієнт, який пов'язує зареєстровані приладом імпульси (counts) і реальні розпади (decompositions). Тому для будь-якого вимірювання розпади / хв. (Dpm - decompositions per min.) Більше імпульсів / хв. (Cpm - counts per min.). Щоправда, для більшості радіонуклідів, що застосовуються в life science, ефективність рідинного сцинтиляційного рахунку складає більше 90%. Однак, тритій вдається вимірювати з ефективність не більше 50ч60%. Зазвичай ефективність рахунку для кожного радіонукліда вказується в технічній документації до приладу, і довгий час негласне змагання між фірмами за більш високу ефективність розрахунків тритію було чи не головним двигуном технічного прогресу в цій області. 14. Усі вимірювальні прилади мають власний "фон" - реєструють якусь кількість імпульсів без джерела іонізуючого випромінювання (радіоактивного препарату). Природа фону різна: космічне випромінювання, електронний шум, вміст природних радіонуклідів у приміщенні, де встановлена ​​вимірювальна апаратура і т.д. Тому мінімально достовірна величина активності, яка вимірюється приладом, ув'язується з фоном і звичайно приймається рівної триразовому перевищення фону даного приладу. Якщо у вашому "епохальне" експерименті активність "головного" зразка ледь-ледь перевищує фон, спробуйте збільшити час вимірювання (можна до 20 хв.) - Тоді достовірність вимірювання зросте. 15. У більшості випадків у life science абсолютні вимірювання активності не потрібні, і набагато важливіше отримати інформацію про відносну активності зразків: розподіл активності за гелю, хроматографічної платівці чи по елюірованним з колонки продуктам; частка субстрату, який перетворився на продукт під дією ферменту; частка ліганда, пов'язаного з рецептором; детекція продуктів метаболізму з'єднання, міченого радіонуклідом, та інші аналогічні завдання. Тому дуже важливо, щоб умови приготування і вимірювання зразків у конкретному експерименті були однаковими, тоді абсолютні похибки у вимірах не зроблять істотного впливу на біологічні результати. Найбільш яскраво цю відносність вимірювань ілюструє широке використання мінімоніторов - приладів, призначених для визначення забруднення поверхонь робочих столів, одягу і т.д. Невеликі кишенькові прилади, що мають іонізаційний лічильник (зазвичай це іонізаційна камера або лічильник Гейгера), виявилися дуже зручними для детекції міченого фосфором-32 фрагмента ДНК в агарозному гелі або міченого йодом-125 білка в ПААГ і т.п. Деякі примудряються за показаннями такого приладу оцінювати включення мічених попередників біосинтезу в біополімери після поділу продуктів реакції, використовують монітори для вимірювання активності зразків на фільтрах, шматках фільтрувальної або хроматографічного паперу і навіть в пробірках. Це зручно і корисно для якісних і напівкількісних оцінок, але слід пам'ятати, що приладові помилки в таких вимірах можуть бути дуже значними і досягати 200-300%. Рідинні сцинтиляційні лічильники вже багато років залишаються головним інструментом для кількісного вимірювання радіонуклідів у life science. Незважаючи на різноманітність конструкцій, з точки зору користувача, всі вони вимірюють активність зразків, вміщених у спеціальний скляний або пластиковий флакон і заповнений рідким сцинтилятором. Оскільки вимірювання активності зводиться до підрахунку спалахів світла, рідина у флаконі повинна бути прозора для рахунку і гомогенна за складом. Всі відхилення від цієї вимоги знижують ефективність розрахунків, причому іноді істотно. Утворення осаду або двофазної змішується рідкої системи, наявність зразків біологічних тканин або фільтрувальних матеріалів - всі ці фактори знижують ефективність розрахунків. Те ж саме стосується добавок багатьох хімічних речовин: кислот, лугів, концентрованих розчинів цукрів, солей, сечовини і багато іншого. Особливо це стосується вимірів тритію, де різниця в ефективності рахунку для гомогенного, майже ідеального, зразка і зразка, нанесеного на хроматографічний сорбент, може бути в 10ч30 разів і навіть більше. Це необхідно враховувати, якщо при складанні балансу за активністю раптом кудись зникне частина радіоактивного матеріалу або звідкись раптово з'явиться "зайве". Склади сцинтиляторів дуже різні і фірми, що виробляють сцинтиляційні коктейлі, часто не розкривають їх склад. Класичний (чи не найбільш перший) рідкий сцинтилятор - це толуольний розчин 2,5-діфенілоксазола (РРО) з добавкою 1,4-ді-[2-феніл-(5-окзазоліл)]-бензолу (РОРОР). Склад: 4 г РРО і 0,2 г РОРОР на 1 л толуолу. Не вдаючись у подробиці, слід підкреслити, що це - неводна система, а водні розчини вважати в такому сцинтилятор не прийнято. Для вимірювання водних проб до такого сцинтилятор додають тритон Х-100 до 30% за обсягом. Іншим варіантом "водолюбних" сцинтилятора є діоксанові: 60 г нафталіну, 4 г РРО, 0,2 г РОРОР, 200 мл спирту і до 1 л діоксану марки "сцинтиляційного". Втім, більшість дослідників сьогодні успішно користуються готовими фірмовими коктейлями, справедливо не замислюючись над їхнім складом. Важливими джерелами помилок для рідинного сцинтиляційного рахунку є "засвітка" сцинтиляційної рідини і електризація рахункових флаконів. Обидва ефекти легко нейтралізуються в часі (не поспішайте відразу вважати, дайте пробам постояти в темному просторі приладу декілька хвилин), крім того, електризація чомусь частіше проявляється на скляних флаконах, і рідше - на одноразових пластикових. Впровадження в технологію біоскринінгу радіометричних методів аналізу спонукало розробників на створення високопродуктивних сцинтиляційних лічильників для вимірювання активності в планшетах. Для радіоактивних ізотопів фосфору прилад використовується у модифікації із зовнішнім твердим сцинтилятором, який і є детектором. Для тритію твердий сцинтилятор додають прямо в лунку планшета у вигляді спеціальних бусинок і, так як ці намистинки є одночасно компонентом біохімічної реакції, то пов'язаний з "бусами" мічений тритієм ліганд вважається сцинтилятором, а не пов'язаний, що знаходиться в розчині, - не рахується. З радіохімічної точки зору ефективність рахунки в таких вимірах дуже низька, але для біоскринінгу важливо відносний розподіл мічених сполук в системі "пов'язаний-незв'язаний", а висока продуктивність і простота операцій виправдовують колосальні витрати на реалізацію таких методів. 2.3. Імміджери Дуже корисною і ефективною виявилася "електронна авторадіографія", що виникла порівняно недавно, як результат розвитку мікроелектроніки та комп'ютерної техніки. Фосфоіміджер - прилад для "електронної авторадіографії" фосфору-32. Касета з багаторазово застосовуваний екран експонується з плоским зразком: гелем, хроматографічної пластинкою і т.п. Потім екран поміщається в прилад, в якому за допомогою лазерного сканування визначається місце розташування і активність радіоактивного матеріалу, експонуватиметься з екраном. Інша варіація на цю тему - це використання газопроточних лічильників для "електронної авторадіографії". Уявіть собі щітку для одягу, кожен волосок якої діаметром 0,2 мм є індивідуальним газопроточним лічильником. Якщо ви поєднаєте таку "щітку" загальним розміром 18 х 24 см з досліджуваним плоским зразком, то на екрані комп'ютера в реальному часі ви зможете спостерігати кількісну картинку розподілу "радіоактивних речовин" на площині вашого зразка. Різні модифікації такого приладу дозволяють працювати практично з усіма радіонуклідами, які застосовуються в life science. Ефективність рахунки в цих приладах, звичайно, не може бути високою, проте для практичної роботи в life science цей недолік з лишком компенсується швидкістю і зручністю "електронної авторадіографії", а також можливістю отримання результату відразу в електронному вигляді. 3. Класифікація та номенклатура Всі радіоактивні джерела з технологічної точки зору поділяються на закриті та відкриті. Закриті джерела - це радіоактивні препарати, поміщені в спеціальну захисну герметичну упаковку (як правило сталеву), - призначені для робіт без розтину захисної оболонки. У молекулярно-біологічних і біохімічних дослідженнях використовують відкриті джерела - тверді, рідкі або газоподібні радіоактивні речовини або їх розчини. Практично всі радіоактивні препарати, що застосовуються в life science - це розчини сполук, мічених радіоактивними ізотопами. Для позначення конкретного ізотопу (в тому числі і радіоактивного), згідно з правилами номенклатури, перед хімічним символом елемента ставиться надстрочечное число, що означає масу ізотопу. Наприклад, ¹⁴ С - ізотоп вуглецю з масою 14. У літературі допускається повне написання хімічного елемента і його маси через дефіс, наприклад, вуглець-14. Зверніть увагу, що пишеться ¹⁴ С, а вимовляється звичайно С-14, тобто для будь-якого ізотопу при написанні першим завжди вказується масове число ізотопу над рядком, а потім символ хімічного елемента, а вимовляють навпаки: спочатку елемент, потім маса ізотопу. Сполуки, мічені радіоактивними ізотопами, ділять на дві групи речовин. По-перше, це конкретні хімічні сполуки, у яких один атом (або декілька) замінений на атом радіоактивного ізотопу того ж елемента, тобто хімічно таке з'єднання ідентично "немічених". По-друге, це молекули сполук, модифіковані за допомогою радіоактивного фрагмента (або додаткового радіоактивного атома), які відрізняються від вихідного немічених з'єднання. До останнього випадку відносяться всілякі кон'югати і модифікації біологічних макромолекул з невизначеним місцем розташування радіоактивного атома, наприклад, молекула імуноглобуліну з введеним ізотопом радіоактивного йоду-125. Більш докладно про це нижче. Для позначення мічених сполук першої групи прийнято у звичайне хімічне найменування молекули вставляти в квадратних дужках найменування ізотопу, яким мечено з'єднання, і його місце в молекулі перед назвою частини молекули, що містить мічений атом. Як приклад нижче наведено найменування тимідин-5'-трифосфату, міченого різними радіонуклідами і в різних положеннях: 16. [6 - ³ H] тимідин-5 'трифосфат 17. ^{[Метил-3} H] тимідин-5 'трифосфат 18. ^[U-3 H] тимідин-5 'трифосфат 19. ^[5'-3 H] тимідин-5 'трифосфат 20. [6,2 ', ^3'-3 H] тимідин-5' трифосфат 21. [2 - ¹⁴ С] тимідин-5 'трифосфат 22. ^[U-14 С] тимідин-5 'трифосфат 23. тимідин -5 ^'[α-32 P] трифосфат 24. тимідин -5 ^'[γ-32 P] трифосфат У прикладах 3 і 7 місце радіоактивного атома в молекулі позначено U - це означає, що точне місце радіоактивного атома невідомо і, можливо, мова йде про рівномірно міченої молекулі. Зазвичай таке буває, якщо спосіб одержання сполуки полягав у вирощуванні мікроорганізму на середовищі, збагаченої цільовим ізотопом, з подальшим виділенням потрібного з'єднання з клітинного лізата. Детальніше методи отримання мічених сполук обговорюються в інших розділах. У прикладах 8 і 9 α і γ - це не тип радіоактивного розпаду, а місце розташування радіоактивних атомів фосфору-32 в метаболізмі препаратутрифосфатні групі. Для найменування другої групи сполук позначення радіонукліда у квадратних дужках виносять перед найменуванням молекули: ^[125 I]-альбумін - альбумін, мічений йодом-125 або [метил - ³ H]-альбумін - альбумін, мічений тритієм за рахунок метилювання молекули ^[3 H] -метильної групою йодистого метилу. 4. Основні радіонукліди в life science Список радіоактивних ізотопів, які використовуються в life science, взагалі вкрай обмежений самою природою. До складу органічних сполук входять водень, вуглець, кисень, азот, а також набагато рідше фосфор і сірка. Отже, для отримання немодифікованих мічених сполук коло можливих радіонуклідів обмежений цими біогенними елементами. Їх характеристики наведено в таблиці 1.

Радіонуклід Період напіврозпаду Питома активність 100% ізотопу Тип розпаду Енергія (max) [MeV] [MCi / mmol] [Бк / моль] 3 H (тритій) 12.43 року 29.05 1,11 x10 15 β 0.0185 14 C 5730 років 0,062 2,3 х10 12 β 0.156 32 P 14.3 днів 9104 0,33 х10 18 β 1.709 33 P 25.4 днів 5138 0,19 х10 18 β 0.249 35 S 87.4 днів 1491 0.5х10 17 β 0.167 125 I 60 днів 2167 0,8 х10 17 ec 0.25

На жаль, радіоактивні ізотопи кисню та азоту мають абсолютно неприйнятний для роботи в life science період напіврозпаду - від декількох хвилин до мілісекунд. Такі ультра короткоживучі ізотопи (УКЖ) вже застосовуються в медицині та техніці, проте їх використання у фізико-хімічної біології вельми проблематично. Перелік радіонуклідів, які можуть використовуватися (і використовуються) для одержання модифікованих молекул, може бути істотно розширений. Такі модифіковані молекули часто використовуються не тільки в life science, але і в медицині (як для діагностики, так і для терапії). Досить популярні для медико-біологічних робіт радіонукліди технецію, хрому та інших. У цьому матеріалі не будуть розглядатися медичні аспекти застосування мічених сполук, тому зосередимося на використанні радіонуклідів, наведених у таблиці 1. Слід зауважити, що всі радіонукліди з таблиці 1 є β-випромінювачами, крім ¹²⁵ I, який "затесався" у цей список швидше на знак "особливих заслуг", про які нижче буде окрема глава. Насправді ¹²⁵ I для мічених сполук практично не використовується, тому що в живих організмах особливого розмаїття молекул, що містять йод, не спостерігається. Взагалі, "ідеальний радіонуклід" для life science повинен відповідати наступним критеріям: 25. Елемент повинен входити до складу всіх органічних молекул. Це зрозуміло, тому що робить можливим введення "міченого атома" в будь-яку молекулу. 26. Період напіврозпаду "ідеального радіонукліда" 10ч100 днів. Це буде відповідати теоретичної молярної активності в діапазоні ^{18 жовтня} Ч10 ¹⁷ Бк / моль і зможе забезпечити високу чутливість методу. 27. Чистий β-випромінювач з максимальною енергією випромінювання не більше 0,4 Мев.Ето дозволяє порівняно просто детектувати радіонуклід і в той же час зберігає високий дозвіл методів, пов'язаних з авторадіографіческой детекцией мічених продуктів. На жаль, жоден з наведених у таблиці радіонуклідів не відповідає "ідеалу". Тритій і вуглець мають дуже великий період напіврозпаду, тобто низьку молярну активність (особливо, вуглець), а дуже низька енергія випромінювання тритію сильно ускладнює його детекцию і радіометрії. Дуже зручні ядерно-фізичні характеристики радіоактивних ізотопів фосфору і сірки не можуть компенсувати обмеженість розповсюдження цих елементів в органічних молекулах. Тому вибір радіонукліда, який передбачається використовувати для дослідження, доводиться робити з урахуванням різних факторів, які детально розбираються нижче. Всі наведені в таблиці радіонукліди - штучні, реакторні ізотопи. У природі існують радіоактивні ізотопи ³ H і ¹⁴ C, але їх зміст дуже низька, і препаративного виділення таких ізотопів як сировини для синтезу мічених сполук є завданням з економічної точки зору абсолютно руйнівною. Коротко способи отримання радіонуклідів з таблиці 1 будуть повідомлені у відповідних розділах. 5. Технічні характеристики мічених сполук Всі препарати мічених сполук, які використовуються в life science, мають технічні характеристики, детально зазначені фірмою-виробником в паспорті (сертифікаті) і коротко - на флаконі з препаратом. Нижче детально розбираються терміни технічних характеристик та їх значення. 5.1. Радіонуклідна чистота [%] Це характеристика радіоізотопної чистоти препарату. Для більшості радіонуклідів, що застосовуються в life science, не дуже важлива. Домішки інших радіонуклідів у тритієвих або ³⁵ S з'єднаннях відсутні. Однак, для сполук, мічених фосфором-33, це найважливіша характеристика, тому що часто наявність домішки фосфору-32 більш 2ч3% робить препарат фосфору-33 досить сумнівним за якістю з точки зору багатьох методик. Іноді фірми-виробники штучно "підігрівають" інтерес біохіміків до препаратів з дуже високою радіонуклідної чистотою. Наприклад, у йоду багато радіоактивних ізотопів зі своїми індивідуальними ядерно-фізичними характеристиками. Найпопулярніший у life science радіоізотопи йоду - ¹²⁵ I. Фірма "Амершам" (Amersham) дуже пишається тим, що пропонує дослідникам ¹²⁵ I з дуже високою радіонуклідної чистотою - вміст домішкового ¹²⁶ I менше 0,01%. У той же час, практично для всіх досліджень у life science, включаючи радіоіммуноаналіз, ця характеристика не є важливою, і зміст інших радіоактивних ізотопів йоду в цільовому ¹²⁵ I може бути 0,1% і навіть 1% без будь-якої шкоди для біологічного осмислення отриманих результатів. 5.2. Радіохімічна чистота [%] Радіохімічна чистота (РХЧ) - це зміст основної речовини, що визначається зазвичай хроматографічно (ВЕРХ або ТШХ) у двох різних системах (умовах). Як правило, РХЧ не нижче 95%. Для більшості дослідників у life science РХЧ починає представляти інтерес, коли вони "угробили" експеримент і намагаються зрозуміти чому це сталося. 5.3. Об'ємна активність [МБк / мл (мки / мл)] Іноді об'ємну активність називають концентрацією радіоактивності (radioactive concentration), що цілком відображає суть. На всі вироблені мічені з'єднання в паспорті (сертифікаті) обов'язково вказується дата паспортизації та "reference data" - дата, на яку дається значення об'ємної активності. Більшість препаратів для life science, особливо сполуки, мічені фосфором-32 або 33, мають високу об'ємну активність, і перевіряти ще раз (переміряти) заново величину, зазначену в паспорті, просто шкода - надто велика витрата матеріалу. Так що дослідники просто розраховують необхідну їм для роботи активність, виходячи їх даних паспорта з урахуванням періоду напіврозпаду використовуваного радіонукліда. Природно, що облік розпаду радіонукліда проводиться для короткоживучих радіоактивних ізотопів: фосфору, сірки і йоду, а для тритію, і тим більше для ¹⁴ З цього не роблять. 5.4. Молярна активність [Бк / моль (Кі / ммоль)] Молярна активність - це активність одного моля речовини, що містить якийсь радіонуклід. Застарілі одиниці виміру Кі / ммоль і раніше, використовуються і навіть частіше, ніж сучасні Бк / моль. Це просто зручніше, тому що величина високої молярної активності (наприклад, фосфору-32), виражена в Бк / моль, часто викликає у біологів паніку. Порівняйте: 5000 Кі / ммоль одно 1,85 х10 ¹⁷ Бк / моль. У зарубіжній науковій літературі частіше використовується термін "специфічна активність" (specific activity), який є синонімом молярної активності. У російськомовній літературі існує термін "питома активність" - активність одного грама (іноді мікрограма) речовини, що містить радіонуклід. Зазвичай така характеристика дається сполукам, молекулярна вага яких не визначено або не відомий. Наприклад, препарати біополімерів (ДНК, РНК, білків) зазвичай характеризують питомою активністю - активністю одного мікрограма речовини. В англомовній літературі термін "специфічна активність" (specific activity) означає і молярну, і питому активність. Молярна активність - найважливіша характеристика міченого з'єднання, причому з кількох причин. По-перше, ви можете оцінити частку власне мічених сполук в препараті, запропонованому вам для роботи. Наприклад, якщо препарат ^L-[35 S]-метіоніну має молярну активність 300 Кі / ммоль, то, враховуючи теоретичну молярну активність (1491 Кі / ммоль) для сірки-35, неважко підрахувати, що в препараті лише п'ята частина молекул містить ізотоп ³⁵ S (300: 1491 = 1 / 5), а інші - "холодні" молекули - не містять радіоактивних атомів. По-друге, можна підрахувати молярну концентрацію міченого препарату. Для цього треба розділити об'ємну активність препарату (Кі / мл) на його молярну активність (Кі / ммоль) і отримати концентрацію речовини в розчині в ммоль / мл (моль / л). Тільки будьте уважні до одиниць і множників, щоб не розділити об'ємну активність у мки / мл на молярну активність в Бк / моль (або навпаки). По-третє, ви можете оцінити гранично досяжну для вашого препарату чутливість виявлення з'єднання. Так, якщо ваш препарат ^[γ-32 P] ATP має молярну активність 1000 Кі / ммоль, то, враховуючи кордон достовірної кількісної реєстрації фосфору-32 в 10 ^-10 Кі, ви зможете визначити 10 ^-10 / 10 ³ = 10 ^-13 ммоль , тобто 10 ^-16 моль речовини. На жаль, ця чудова чутливість на практиці часто залишається недосяжною, оскільки у кількісних вимірах в life science зазвичай "біологічний фон" експерименту набагато вище фізичного або приладового. Це докладно буде обговорюватися на прикладі використання сполук, мічених фосфором-32. Слід підкреслити один дуже цікавий феномен, пов'язаний з молярною активністю. Якщо молярна активність міченого препарату близька до теоретично можливої ​​(більше 90% від максимальної), то, незалежно від періоду напіврозпаду радіонукліда, величина молярної активності препарату буде практично постійною. Це добре видно на прикладі ³³ Р-ортофосфорної кислоти з молярною активністю близько 5000 Кі / ммоль. Дійсно, згідно зі схемою радіоактивного розпаду фосфор-33 перетворюється на сірку-33 і, отже, разом з спадання кількості радіоактивних атомів (розпадом) убуває (зменшується) кількість молекул фосфорної кислоти, тому що з фосфорної H ^{березня} ₁₉₃₃ рo ₄ утворюється сірчана (H ^лютого ₁₉₃₃ SO _4). 6. Радіонуклід ³ Н (тритій) Тритій - радіоактивний ізотоп водню, "чистий" β-випромінювач, який легко напрацьовується в реакторі в значній кількості. Схема розпаду: ³ Н -> e + ³ He Для life science тритій є самим затребуваним і зручним радіонуклідом з кількох міркувань. По-перше, практично будь-яку органічну молекулу можна помітити тритієм (лише б містила водень). По-друге, тритій легко вводиться в різні сполуки, і хімія цих процесів розроблена краще, ніж для будь-якого іншого радіонукліда. По-третє, тритій - це найдешевший радіонуклід, з використовуваних в life science. Є прекрасна докладна монографія з синтезу сполук, мічених тритієм, (В. П. Шевченко, І. Ю. Нагаєв, М. Ф. Мясоєдов, "мічені тритієм ліпофільні сполуки" Москва, вид. "Наука" 2003р.), Тому я тільки коротко перелічу основні методи отримання ³ Н-з'єднань. 28. Хімічний синтез гідруванням ³ Н ₂ ненасичених зв'язків, дегалоідірованіе і відновлення гідроксильних або карбонільних сполук. 29. Каталітичний або термоактивованої водневий обмін. 30. Модифікація сполук за допомогою ³ Н-метильних або ³ Н-ацетільних груп. 31. Гідрування Li [B ³ H _4] або Li [Al ³ H _4] 32. Введення ³ Н за рахунок тритієвої води (гідроліз або обмін). 33. Ферментативний синтез з ³ Н-мічених попередників. Можна додати біосинтез - вирощування мікроорганізмів на середовищі, що містить ³ Н-попередник (наприклад, ^{[метил-3} H] тимідин, для отримання міченої ДНК), з подальшим виділенням цільового з'єднання. Однак, цей спосіб досить специфічний і зазвичай застосовується тільки в лабораторній практиці для отримання біополімерів. Історично так склалося, що мічені тритієм компоненти нуклеїнових кислот і амінокислоти стали інструментами для кількох поколінь учених. Пізніше до тритію додався фосфор-32 (і фосфор-33) для нуклеїнових кислот і сірка-35 для білків, і частка робіт з тритієм в цих напрямках знизилася. Для дослідників ліпідів, простагландинів, гормонів, вуглеводів, антибіотиків, вітамінів та багатьох інших класів сполук, тритій - головний (часто єдиний доступний) інструмент підвищення чутливості методів. Це ж стосується досліджень рецепторів, модуляторів і взагалі "сигнальних" систем організмів. Тому тритій, що не має поки що особливих альтернатив, як і раніше, залишається основним "робочим" радіонуклідом в life science. Головним недоліком тритію є трудність його детекції та кількісного вимірювання через занадто "слабкого" β-випромінювання. Найбільш ефективний спосіб вимірювання - рідинної сцинтиляційний рахунок, про який більш докладно дана інформація в розділі 2.2. Особливо слід підкреслити, що саме для тритію зниження ефективності рахунку ("гасіння") відіграє істотну роль у кількісних вимірах. Авторадіографія тритієвих сполук теж має ряд специфічних особливостей. Пряма детекція β-випромінювання тритію фоточутливим матеріалом - процес дуже довгий і використовується рідко. Зате була запропонована оригінальна модифікація, згідно з якою зразок, що містить тритій, обробляється сцинтиляційними речовинами, і авторадіографія перетворюється на своєрідну "автофлюорографію". Для пластин ТШХ - це обприскування розчином РРО, який вже згадувався в розділі "рідинної сцинтиляційний рахунок". Після висушування така платівка експонується з рентгенівською плівкою, і далі - як звичайно. Для ПААГ запропонована процедура просочення гелю тим же РРО. Спочатку доводиться замістити воду в гелі на диметилсульфоксид (DMSO), тому що РРО не розчиняється у воді. Потім гель просочують розчином РРО в DMSO, після чого назад заміщають DMSO на воду (РРО випадає в гелі в осад і гель ставати білим). Після всіх цих процедур гель висушують і експонують з рентгенівською плівкою. "Занудність" цих операцій окупається сторицею - виходить можливість детекції продуктів, мічених тритієм, (наприклад пептидів, мічених ³ Н-лейцином) відразу після електрофорезу в ПААГ. Ще одна "делікатна" сторона використання сполук, мічених тритієм, - це хімічна стабільність таких сполук. Як не дивно на перший погляд, але радіоліз - хімічне руйнування молекул під дією іонізуючого випромінювання - саме для сполук тритію грає дуже істотну роль. Це важливо пам'ятати, тому що великий період напіврозпаду (12 років) нібито дозволяє використовувати синтезовані речовини протягом місяців (а іноді і років) з моменту паспортизації. Тут треба бути дуже обережним, тому що часто при неправильних умовах зберігання замість цільового з'єднання залишається складна суміш продуктів радіолізу, де потрібного з'єднання не більше третини. Типова помилка - зберігання водного розчину тритієвого з'єднання в замороженому вигляді. У замороженому вигляді високомеченние тритієм з'єднання "розсипаються" набагато швидше, ніж у розчині. Тому для тривалого зберігання мічених тритієм сполук при -20 ° С обов'язково додають спирт або іншій "антифриз", що перешкоджає замерзанню розчину. З хімічної стабільністю сполук тритію пов'язана ще одна проблема. Стійкість хімічного зв'язку водню (будь-якого ізотопу водню) з іншими атомами в молекулі залежить від природи цього зв'язку. Відповідно, можливість обміну водню в молекулі міченого з'єднання з розчинником, наприклад з водою, обов'язково треба враховувати. Водень карбоксильної групи у воді за рахунок електролітичної дисоціації обмінюється миттєво, а водень в алкільного або арильному фрагменті молекули обмінюється дуже важко - при нормальних умовах обміну немає. Між цими "крайніми" прикладами знаходиться величезне різноманіття молекул з різною здатністю до "водневого обміну", і для різних біохімічних процесів питання про стабільність тритієвої мітки може бути або надзвичайно актуальним або зовсім несуттєвим. 7. Радіонуклід ¹⁴ C Радіонуклід ¹⁴ C отримують опроміненням нітриду алюмінію по реакції: ¹⁴ N + ⁰ n -> ¹⁴ C + ¹ p у вигляді ¹⁴ C-карбіду. З нього ¹⁴ C виділяють у вигляді ¹⁴ CО _2, який зазвичай поглинають Ba (OH) _2, і отриманий ¹⁴ C-карбонат є основним радіоактивним сировиною для всіх синтезів ¹⁴ C-з'єднань. Всі достаток ¹⁴ C-мічених сполук в каталогах різних фірм-виробників синтезується двома шляхами: 34. Біосинтез. У живильне середовище до мікроорганізмів (зазвичай це водорості типу хлорели) додають ¹⁴ CО ₂ в якості єдиного джерела вуглецю. Після вирощування з біомаси виділяють рівномірно мічені ¹⁴ C-з'єднання. Таким шляхом отримують амінокислоти, нуклеозиди, цукру, ліпідні компоненти та інші природні сполуки. Іноді ¹⁴ C-біомасу водоростей використовують як джерело вуглецю (свого роду мічений пептон) для вирощування штаму-продуцента якого-небудь важливого сполук. 35. Хімічний синтез. Синтез всього різноманіття органічних речовин з карбонату - класична задача органічної хімії. Знамениті ланцюжка перетворень органічних сполук (кошмар багатьох поколінь студентів і школярів) повною мірою реалізовані в синтезі ¹⁴ C-з'єднань. Всі органічні сполуки, які не вдається отримати біосинтезом, синтезують хімічно.

Схема розпаду вуглецю-14: ¹⁴ C -> ¹⁴ N + e. Хоча з детекцией ¹⁴ C особливих проблем не виникає, застосування ¹⁴ C-з'єднань в life science вкрай обмежена. Це пов'язано з дуже низькою молярною активністю ¹⁴ C-з'єднань, і навіть кратно мічені молекули не змінюють ситуацію радикально. Зазвичай молярна активність ¹⁴ C-з'єднань не перевищує 20ч50 мки / ммоль, (у сполук тритію майже в 1000 разів вище, а у фосфору-32 або 33 ще в 100 разів вище) і, отже, по чутливості методи з використанням ¹⁴ C-з'єднань значно поступаються методам, в яких використовують ³ Н-з'єднання. На сьогоднішній день ¹⁴ C-з'єднання міцно утримують за собою тільки одну "нішу" у life science - це вивчення метаболізму нових лікарських (або косметичних) препаратів. Для вивчення деградації, накопичення в органах, швидкості і шляхів виведення, біодоступності і інших аспектів метаболізму рівномірно мічені ¹⁴ C-з'єднання залишаються затребуваними, не дивлячись на дуже високу вартість і трудомісткість синтезу. 8. Радіонукліди ³² P і ³³ P Радіонукліди ³² P і ³³ P - дуже зручні для life science, але їх застосування обмежене природою, тому що фосфор у природних органічних сполуках присутня набагато рідше, ніж водень, вуглець або кисень. Отримання радіоактивних ізотопів фосфору ⁽³² Р і ³³ Р) з технічної точки зору однаково: опромінення елементарної сірки особливої ​​чистоти в ядерному реакторі. Однак, з економічної точки зору різниця колосальна. Справа в тому, що ³² Р отримують по реакції ³² S + ⁰ n -> ³² P + ¹ p у вигляді ³² P-ортофосфату. Стартовий матеріал мішені - природна елементарна сірка, що містить більше 92% стабільного ізотопу ³² S. Ізотоп ³³ Р отримують по реакції ³³ S + ⁰ n -> ³³ P + ¹ p також у вигляді ³³ P-ортофосфату. Але мішенню для цієї реакції служить ізотоп ³³ S, вміст якого в природі складає долі відсотка. Для отримання ³³ Р високої якості необхідно використовувати для опромінення тільки ³³ S із збагаченням не нижче 98,5 ч99, 0%. Це відразу істотно збільшує вартість продукту, тому що вартість збагаченої сірки-33 більше природної сірки приблизно на 6 порядків (в мільйон разів). Тому сполуки фосфору-33 завжди будуть дорожче аналогічних сполук, мічених фосфором-32. Схеми розпаду радіонуклідів фосфору: ³² P -> ³² S + e і ³³ P -> ³³ S + e Вихідним радіоактивним сировиною для отримання сполук, мічених радіоактивними ізотопами фосфору, завжди є ортофосфорна кислота ⁽³² Р або ³³ Р відповідно). Так як хімія та біохімія ³² Р і ³³ Р абсолютно однакові, надалі йтиметься про фосфор-32, з урахуванням того, що все це поширюється і на фосфор-33. В особливих випадках, коли необхідно, будуть відзначатися відмінності. Власне сама ³² Р-орто-фосфорна кислота в life science використовується рідко. Зазвичай це вирощування мікроорганізмів (бактерій або дріжджів) або культури клітин у середовищі, що містить ³² Р-ортофосфат. Отриману мічену біомасу відокремлюють від культуральної рідини, а потім досліджують. Кілька зауважень по цьому процесу. 36. Вихідна ³² Р-ортофосфорна кислота без носія (цей термін означає, що у препарат не додавали спеціально нерадіоактивних ортофосфорну кислоту) має молярну активність не менше 5000 Кі / ммоль, і, відповідно, концентрація власне фосфату в середовищі тільки за рахунок радіоактивного фосфору буде не вище 10 ^-8 М. Для біологічних (мікробіологічних) робіт така концентрація фосфату в середовищі надто низька - клітини будуть "вважати", що фосфору немає взагалі. Тому у культуральне середовище обов'язково додається "холодний" фосфат у концентрації, необхідної для засвоювання. Зазвичай це не нижче 10 ^-4 М. Не намагайтеся "включити" радіоактивний фосфат в культуру клітин без "холодного" носія. Частина радіоактивного фосфату просто сорбується на поверхні посуду або клітин, а включення в клітинний обмін не відбудеться. 37. Оптимальна концентрація фосфату для таких експериментів підбирається індивідуально для різних завдань і видів кліток. "Переносити" дані за оптимальною концентрації з одного виду експериментів (або клітин) на інший треба обережно. Основними сполуками фосфору-32, застосовуваними в life science, є нуклеозид-5'-трифосфати, мічені в альфа або гамма положенні. В кінці 60-х - початку 80-х років ХХ століття було розроблено кілька способів синтезу цих сполук, але після роботи Джонсона і Валсеса, запропонований ними ферментативний спосіб став рутиною як для лабораторного синтезу, так і для масштабного виробництва. Хімічні методи синтезу мічених фосфором-32 сполук використовуються, коли немає ферментативного шляху, наприклад для синтезу синтетичних аналогів нуклеотидів. Вимірювання активності радіонуклідів ³² Р і ³³ Р - операція досить проста - будь-який рідинної сцинтиляційний β-лічильник вважає ³² Р і ³³ Р з ефективністю не нижче 90%. Для фосфору-32 використання сцинтилятора зовсім не обов'язково. Зазвичай вимір фосфору-32 проводять за рахунок "світіння Черенкова" - ефекту, обумовленого взаємодією високоенергетичних електронів з навколишнім середовищем. Не вдаючись у фізичні аспекти черенковского світіння, слід знати, що сцинтиляційні лічильники "вважають" фосфор-32 без будь-якого сцинтилятора з ефективністю близько 30%. Черенковське світіння фосфору-32 можна легко побачити. Нанесіть на підкладку (платівку ТШХ або фільтрувальний папір) 1 мкл розчину ³² Р-ортофосфорної кислоти (або будь-якого іншого з'єднання фосфору-32) з активністю 50 мкКі (близько 2МБк) і помістіть підкладку між площинами двох шматків звичайного скла, товщиною 4ч5 мм. У темряві (тільки без "червоного" світла) через 3ч5 хв. адаптації очі буде добре видно зеленувато-блакитне світіння плями, відповідного точці нанесення розчину на підкладку. Не тримайте таке джерело близько до очей - все чудово видно з відстані 40ч60 див. Дуже корисним для роботи є можливість вимірювання фосфору-32 прямо в пластикових пробірках, поміщених в стандартний сцинтиляційний флакон. На практиці це означає, що ви можете виміряти активність свого зразка, наприклад, вирізаний шматок з агарозного гелю або пробірку з фракцією елюата хроматографічного розділення, а потім використовувати зразок для подальшої роботи. Така особливість фосфору-32 є його найважливішою перевагою перед іншими β-радіонуклідами, застосовуваними в life science. Всі інші β-радіонукліди, наведені вище в таблиці 1, включаючи фосфор-33, вимагають для вимірювання в сцинтиляційному лічильнику прямого контакту з сцинтиляційної рідиною, тобто додавання зразка прямо у флакон, що містить сцинтилятор. Природно, після цього зразок для подальшої роботи втрачається. Серед радіонуклідів, що застосовуються в life science, фосфор-32 є "рекордсменом" за чутливістю методик з його використанням. Проте, простий розрахунок чутливості методу (поділіть звичайний межа виявлення фосфору-32, тобто близько 3ч4 Бк, на максимальну молярну активність використовуваного з'єднання, тобто близько 2х10 ¹⁷ Бк / моль) показує величину близько 10 ^-17 благаючи. На жаль, це неправильно. Причина цього в високому "біологічне" фоні. Наприклад, при постановці ДНК-полімеразної реакції контрольна проба, в яку додають усі компоненти реакції крім ферменту, також показує деяке "включення" радіоактивного фосфору в ДНК, насправді обумовлене просто неспецифічної сорбцией радіоактивного попередника біосинтезу. Така неспецифічна сорбція є завжди в будь-якому біохімічному експерименті і фактично чутливість методу буде визначатися величиною цього "біологічного" фону. Наприклад, в реакцію додано 0,1 МБк ^[α-32 P] dNТР (це приблизно 2х10 ⁶ СРМ по Черенкова), ферментатівое включення в ДНК близько 30%, а неспецифічна сорбція - фон - складає близько 0,1%, тобто . 2х10 ³ СРМ. Кордон достовірності визначається величини буде визначатися саме неспецифічної сорбцією (у цьому прикладі 2х10 ³ СРМ), яка зазвичай набагато вище фону вимірювальної апаратури. У цьому прикладі фон 2000 СРМ, і, отже, достовірна величина вимірюваного ефекту повинна бути не нижче 6000 СРМ, що в 30 разів знижує чутливість в порівнянні з "ідеальною" розрахункової. Використання фофора-32, а пізніше і фосфору-33, починалося ще в 50-х роках ХХ століття, проте після розробки методів секвенування ДНК за допомогою фосфору-32 попит на з'єднання, мічені фосфором-32, досяг просто величезних величин. У "піке" споживання нуклеотиди, мічені фосфором-32, вироблялися в світі в обсязі кілька десятків кюрі щомісяця (це десятки тисяч фасовок кожен місяць), і тільки флюоресцентні методи секвенування спустили споживання радіоактивного фосфору з позахмарних висот до нинішнього стану. Традиційно мічені фосфором нуклеотиди використовуються в кількох напрямах: 38. Введення в ДНК (РНК) за рахунок нуклеозид-5 '- ^[α-32 Р]-трифосфато і вивчення відповідних ферментів. 39. Введення в олігонуклеотиди ³² Р фосфорилюванням 5'-кінця за допомогою ^[γ-32 P] ATP і полінуклеотідкінази. 40. Фосфорилювання білків протеїнкіназа за допомогою ^[γ-32 P] ATP. Найбільш затребуваним міченим з'єднанням фосфору-32 є ^{аденозин-5'-[γ-32} P] трифосфат, який звичайно скорочено позначають ^[γ-32 P] АТР. Це цілком з'ясовно, тому що крім широко відомої методики введення ³² Р-мітки на 5'-кінець олігонуклеотиду за допомогою Т4 полінуклеотідкінази, ^[γ-32 P] АТР використовують для вивчення різних фосфотрансфераз (кіназ), в тому числі і для біоскринінгу хімічних бібліотек протеїн-кіназнимі тестами. Нуклеозид-5'тріфосфати, мічені фосфором-32 в α-положенні, скорочено позначають ^[α-32 Р] Nтр або ^[α-32 Р] dNТР (рибо-або 2'-дезоксирибонуклеотидів відповідно) і використовують, в основному, для введення "мітки" у нуклеїнові кислоти за допомогою РНК-та ДНК-полімераз. Природно, сюди ж примикають дослідження біосинтезу нуклеїнових кислот і їх ферментативного апарату. Технологія введення ³² Р-мітки в нуклеїнові кислоти докладно викладена в "класиці методів" (Маниатис Т. Фріч Е. Самбрук Дж. "Молекулярне клонування" М. "Світ" 1984 р.). Тому я зазначу лише деякі характерні для початківців помилки. Цілком природне прагнення кожного дослідника отримати мічений препарат ДНК (наприклад ДНК-зонд для гібридизації) з максимальною питомою активністю має свої обмеження. Вважається, що препарат ДНК, що має питому активність не менше 10 ⁸ СРМ на мкг ДНК, "помітити" добре і може дати при гібридизації чутливість, близьку до максимальної. Якщо питома активність препарату ¹⁰ липня Ч10 ⁸ СРМ на мкг ДНК, то результат вийде досить посередній, а якщо синтезований вами препарат має питому ¹⁰ червня СРМ на мкг ДНК, то ви щось зробили неправильно - такий препарат до роботи мало придатний. Ще одна характерна помилка початківців дослідників - спроба синтезу високомеченного ДНК-зонда з допомогою заміни нерадіоактивних dNTP на ^[α-32 Р] dNТР. На жаль, спроби використовувати для синтезу міченої ДНК 2ч3, а іноді і всіх 4-х мічених ^[α-32 Р] dNТР замість одного, заздалегідь приречені. У кращому випадку використання двох мічених ^[α-32 Р] dNТР дасть майже такий же результат (як правило, все-таки трохи нижче) як використання одного ^[α-32 Р] dNТР. В інших варіантах, незалежно від конкретних нуклеотидів, питома активність такий ³² Р-ДНК буде істотно нижче. Це зумовлено двома причинами. По-перше, оптимальна концентрація dNTP для синтезу міченої ДНК не нижче 10 мкМ (часто роблять ще вище), а молярна концентрація міченого ^[α-32 Р] dNТР в реакції - приблизно 0,2 ч0, 4 мкМ. Заміна "холодного" dNTP на ^[α-32 Р] dNТР знижує концентрацію в 20ч40 разів. Отже, заміна всіх dNTP на радіоактивні ^[α-32 Р] dNТР знижує концентрацію всіх попередників біосинтезу до величин нижче К _м (константи Міхаеліса) для кожного dNТР, що в даному випадку майже зупиняє реакцію. По-друге, хімічна чистота "холодних" dNTP, як правило, вище ^[α-32 Р] dNТР і, відповідно, кількість домішок, здатних інгібувати ДНК-полімеразу, зростає, якщо замінювати всі dNTP на відповідні ^[α-32 Р] dNТР . Аналогічна ситуація спостерігається і при використанні ^[α-32 Р] Nтр у синтезі РНК. Так як величина Км більшості РНК-полімераз знаходиться в інтервалі 10ч100 мкМ, то використовувати [α ^Р-32] Nтр без додавання в реакцію "холодного" трифосфату до прийнятної концентрації безглуздо - реакція не йде. Більш того, РНК-полімерази більш "капризні", ніж ДНК-полімерази, і вимоги до хімічної чистоті всіх інгредієнтів, в тому числі і мічених попередників біосинтезу РНК, ще більш жорсткі. Всі фірми-виробники нуклеозид-5'тріфосфатов, мічених фосфором-32 (або 33), постачають ці сполуки з добавками, що знижують хімічну деструкцію речовин, обумовлену впливом іонізуючого випромінювання, і в кріостатах з сухим льодом (при -70 ° С). Такі добавки, "продовжують" життя міченим сполукам, отримали назву радіопротекторів - за аналогією з речовинами, що знижують шкідливий вплив іонізуючого випромінювання на живі організми. Кожен виробник використовує свої, як правило, запатентовані радіопротектори, що подовжують терміни використання мічених препаратів. Часто такі радіопротектори (або їх комбінації) пофарбовані у яскраві кольори, що створює певну зручність для роботи - добре видно навіть мінімальний обсяг пофарбованого міченого з'єднання. Природно, що найважливіша вимога до радіопротектор для мічених сполук в life science - це нетоксичність або "нешкідливість" самого радіопротектора та продуктів його радіолізу для тих біологічних та ферментативних систем, в яких використовується даний мічений препарат. Іншими словами, радіопротектор не повинен брати участь у біологічному процесі, який ви збираєтеся вивчати за допомогою міченого сполуки, що містить радіопротектор. Сполуки, мічені фосфором-32 або фосфором-33, які виробляли і виробляють у Росії, пофарбовані за рахунок радіопротектора в яскраво-червоний колір. При тривалому зберіганні колір буде "жовтіти". Пожовклий препарат краще викинути відразу - весь радіопротектор в такому препараті вже зруйнувався, і нічого хорошого від його радіоактивних залишків чекати не слід. Взагалі, саморадіоліз сполук, мічених фосфором-32 або фосфором-33, дуже незручний для роботи явище, і його треба враховувати. Без радіопротекторів мічені фосфором-32 з'єднання в концентрованому розчині (більше 15 мки / мл) можуть зберігатися дуже недовго, а в сухому вигляді залишати їх довше декількох годин не слід, тому що швидкість хімічних перетворень, під дією іонізуючого випромінювання в цьому випадку дуже висока. Основна відмінність фосфору-33 від фосфору-32 полягає в енергії β-випромінювання цих радіонуклідів, тому що відмінність в періоді напіврозпаду менше ніж у 2 рази неістотно. При цьому перевага більш слабкого випромінювання фосфору-33 (крім психологічного комфорту) проявляється тільки при необхідності авторадіографії з високою роздільною здатністю близько розташованих мічених продуктів, наприклад, автограф гелю після електрофоретичного розділення мічених фрагментів нуклеіових кислот. Дійсно, ефективність "ручного радіоактивного" сиквенсу визначалася роздільною здатністю електрофоретичного розділення продуктів реакції термінації синтезу ДНК (у методі Сенгера) або фрагментів хімічного розщеплення ^[5'-32 P]-одноланцюжковою ДНК (за Максаму-Гілберта). Для ³² Р-мічених фрагментів з одного гелю кваліфікований фахівець міг "прочитати" 350ч400 нуклеотидів. "Зубри" секвенування ДНК в Москві та Новосибірську довели цю величину до 700 нуклеотидів. Одного разу, автору цього огляду в новосибірському Академмістечку з гордістю продемонстрували автограф гелю, з якого вдалося "прочитати" майже 750 нуклеотидів. У науковому фольклорі зустрічалися навіть більш високі величини (аж до 1000), однак, таких задокументованих результатів я не зустрічав. Перехід на фосфор-33 тільки за рахунок більш м'якого β-випромінювання відразу збільшував дозвіл в 1,5 ч2 рази і, отже, підвищував продуктивність праці при сиквенирування ДНК. Втім, автоматичні секвенатори ДНК, використовують флюоресцентную мітку, повністю припинили цю гонку за продуктивністю "ручного сиквенсу" з використанням радіоактивних ізотопів. 9. Радіонуклід ³⁵ S Напрацювання радіонукліда сірки-35 проводиться у ректора опроміненням KCl або NaCl з реакції ³⁵ Cl + ⁰ n -> ³⁵ S + ¹ p у вигляді ³⁵ S-сульфату. Деякі специфічні методики приготування зразків KCl для опромінення дозволяють одержувати ³⁵ S у вигляді елементарної сірки. Схема розпаду сірки-35: ³⁵ S -> ³⁵ Cl + e. Зручний період напіврозпаду і цілком прийнятна енергія β-випромінювання роблять сірку-35 дуже популярним радіонуклідом у своїй "ніші", викликаючи досаду малої поширеністю сполук сірки в живих організмах. У life science сірка-35 використовується, в основному, для введення "мітки" у білок за рахунок ³⁵ S-метіоніну або (рідше) ³⁵ S-цистеїну. Амінокислоти, мічені сірої-35, отримують біосинтезом, вирощуючи бактеріальну біомасу на середовищі, що містить ³⁵ S-сульфат. Після кислотного гідролізу ³⁵ S-біомаси з білкового гідролізату виділяють амінокислоти. Іноді фірми-виробники замість індивідуальних ³⁵ S-амінокислот пропонують просто ³⁵ S-білковий гідролізат, який може бути використаний для вирощування культури клітин в ³⁵ S живильному середовищі. У 80-х роках ХХ-століття на піку буму секвенування ДНК за допомогою радіоактивних ізотопів фірма Амершам запропонувала використовувати замість нуклеозид-5'-трифосфату, мічених фосфором-32 (або 33), нуклеозид-5'-трифосфати, мічені сірої-35 по фосфатної групи, тобто ³⁵ S-тіофосфати. Однак, незважаючи на широку рекламу, великого поширення цей варіант секвенування ДНК так і не отримав. По-перше, робота з радіоізотопами фосфору була звичніше, а при масовій роботі і регулярних поставках "свіжої мітки" надійніше. По-друге, що з'явилися незабаром флюоресцентні автоматичні секвенатори зробили цей напрямок просто непотрібним. Тим не менш, в арсеналі life science залишилися нуклеозид-5 '- ^[γ-35 S] тіотріфосфати і нуклеозид-5' - ^[α-35 S] тіотріфосфати для вирішення спеціальних завдань, наприклад, ензимології протеїнкіназ або ензимології біосинтезу (деградації, корекції ) нуклеїнових кислот. Головним недоліком сполук, мічених сірої-35, які використовуються в life science, є їх низька хімічна стабільність. При тому, що процеси радіолізу для цих сполук менш критичні, ніж для тритію або фосфору-32, ³⁵ S амінокислоти і тіотріфосфати легко окислюються, тому їх важливо зберігати при -20 ° С (краще -70 ° С) і контролювати чистоту перед використанням. 10. Радіонуклід ¹²⁵ I Серед радіоактивних ізотопів йоду найпопулярнішим для дослідницьких робіт у life science є ¹²⁵ I. Це реакторний ізотоп, що виходить із стабільного ізотопу ксенон-124. Серед радіонуклідів у таблиці, наведеної в розділі 4, йод-125 єдиний γ-випромінювач, хоча тип розпаду (точніше ядерного перетворення) - електронне захоплення, в результаті якого йод перетворюється на телур з виділенням γ-кванта. Йод-125 - дуже зручний для детекції радіонуклід. По-перше, його можна вимірювати сцинтиляційних γ-лічильником (не плутайте з рідинним сцинтиляційних β-лічильником), і весь радіоіммуноаналіз в пробіркових варіанті був побудований на цих вимірах. По-друге, йод-125 чудово детектується авторадіографіческі на рентгенівській плівці або "електронної авторадіографія" за допомогою іміджера. Нарешті, йод-125 можна вимірювати на рідинному сцинтиляційному β-лічильнику у флаконі з сцинтилятором, як тритієвих зразок, за рахунок електронів Оже. Незважаючи на широке застосування йоду-125 в life science, власне ¹²⁵ I-мічені сполуки майже не використовуються. Правильніше говорити про використання йоду-125 для "мічення" біологічних макромолекул, тобто отримання мічених сполук другої групи - модифікованих з'єднань (див. розділ 3). Тому самим затребуваним з'єднанням йоду-125 в life science є розчин йодистого калію - K ¹²⁵ I - початковий матеріал для введення радіонукліда в потрібну молекулу. Основним "споживачем" йоду-125 є дослідження білків і пептидів. Традиційно йодування білків проводять в нейтральній або слабко-кислому середовищі в присутності окислювача, який окислює йодид, забезпечуючи його реакцію з амінокислотними залишками білку. Найлегше йод приєднується по залишках тирозину і набагато гірше - за залишками фенілаланіну, триптофану або гістидину. Йодований тирозинових залишок практично не змінює фізико-хімічні та імунологічні властивості білка, що дуже важливо для подальшого використання міченого препарату. В якості окислювача використовувалися самі різні агенти: хлорамін Т, "йодоген", перекис водню з лактопероксідаза і навіть катод полярографа (при електрохімічному окисленні). Кожен метод має свої особливості, але загальний недолік для всіх - це окислення, яке для багатьох білків призводить до втрати (чи змін) ними своїх властивостей і функцій. Навіть короткочасний вплив окислювача (реакція з хлораміном Т триває зазвичай 30ч40 сек.) Для багатьох білків неприпустимо. Тому було запропоновано реагент Болтона-Хантера - реагент, ацилюється вільні аміногрупи білків. Така модифікація білка проходить без окислення, однак ацилювання аміногрупи змінює фізико-хімічні характеристики вихідного білка і може значно змінити його імунологічні властивості. Особливо це стосується невеликих молекул, наприклад, пептидів, де кількість антигенних детермінант обмежена розмірами самої молекули. Тим не менш, йодування білків і пептидів йодом-125 широко використовується для різних досліджень, особливо імунологічних, рецепторних, гормональних та ін Такі ¹²⁵ I-мічені пептиди також використовуються для досліджень, пов'язаних з розподілом пептидів по органах і тканинах експериментальних тварин та їх фармакокінетиці . Були зроблені спроби використовувати ¹²⁵ I для досліджень нуклеїнових кислот. Дійсно, можна "пройодіровать" ДНК, використовуючи хлорид талію і K ¹²⁵ I, для введення "мітки" по залишках цітідіна (утворюється 5-йодцітідін). Можна вводити ¹²⁵ I в ДНК за рахунок ферментативного синтезу, використовуючи ДНК-полімеразу та [5 - ¹²⁵ I] цітідін-5 'трифосфат - ¹²⁵ I-аналог dCTP. Тим не менш, широкого поширення ці методики не отримали, оскільки особливих переваг у ¹²⁵ I перед ³² Р немає. Крім того, високомеченная ¹²⁵ I ДНК набагато швидше деградує під дією продуктів радіолізу і електронів Оже, ніж ДНК, мічених фосфором-32 або фосфором-33. 11. Основи радіаційної безпеки Всім, хто працює з джерелами іонізуючого випромінювання, у тому числі з радіоактивними речовинами, доводиться отримувати допуск до роботи: проходити медкомісію і здавати іспит зі знання норм і правил радіаційної безпеки. Можливо, найяскравішим прикладом тісного переплетення фундаментальних академічних досліджень і утилітарно-прикладних розробок є правила роботи з джерелами іонізуючого випромінювання. Вся інформація для проведення робіт з радіоактивними речовинами викладена у двох основних документах: "Норми радіаційної безпеки" (НРБ) і "Основні санітарні правила" (ОСП). Ці нудні суворі документи існують вже більше 30-ти років. Регулярно (приблизно раз на 10 років) інформація в цих документах оновлюється відповідно до розвитку радіобіологічних і біофізичних досліджень, вносяться зміни, іноді вельми серйозні, але загальна структура документів не змінюється. НРБ встановлює нормативи по всіх параметрах, пов'язаних з радіоактивністю: дози та рівні опромінення, вміст різних радіонуклідів у воді, повітрі і т.д., рівні забруднення радіонуклідами та ін Слід підкреслити, що це не військово-технічний або медико-терапевтичний документ, а загальні норми, встановлені для всіх організацій і осіб, які постійно працюють з джерелами іонізуючого випромінювання, у тому числі з радіоактивними речовинами. Хоча в НРБ і ОСП дані коротко визначення основних термінів і понять, нижче я спробую спрощено систематизувати цю інформацію для початківців працювати з радіоактивними речовинами. Експозиційна доза - енергетична характеристика γ-і рентгенівського випромінювання, яка оцінюється за ефектом іонізації сухого атмосферного повітря. Одиниця експозиційної дози рентген - потік γ-або рентгенівського випромінювання, який в 1 см ³ сухого повітря утворює 2х10 ⁹ пар іонів. Ця найпопулярніша одиниця виміру в дозиметрії, хоча і є застарілою і позасистемною. Поглинена доза - власне це і є характеристикою небезпеки випромінювання, так як визначається як відношення поглиненої енергії іонізуючого випромінювання до маси опроміненого речовини. Одиниці поглиненої дози - радий і грей. Радий - це позасистемна (але популярна) одиниця - rad (radiation absorbed dose) - дорівнює 100 ерг / м. Грей - одиниця в системі СІ, що дорівнює 1 дж / кг. Значить, 1 Гр (грей) дорівнює 100 рад. Еквівалентна доза - добуток поглиненої дози випромінювання на якийсь коефіцієнт якості випромінювання, що враховує несприятливі біологічні наслідки. Одиниці виміру - бер і зіверт. Бер - біологічний еквівалент рентгена (іноді говорять рада) - доза будь-якого виду іонізуючого випромінювання, яка виробляє такий самий вплив на біологічні об'єкти як доза γ-або рентгенівського випромінювання в 1 Р (рентген). У системі СІ прийнятий зіверт - еквівалентна доза, відповідна поглиненої доза в 1 Гр (грей) з коефіцієнтом якості 1. Ефективна доза - величина, яка використовується для оцінки міри ризику виникнення віддалених наслідків опромінення всього тіла людини і його окремих органів і тканин з урахуванням їх радіочутливості. Вся ця "блакитна каламуть" на дозове тему для нормальної роботи, звичайно, не потрібна. Тим більше для роботи в life science. Дозиметричні прилади (точніше, прилади радіометричного контролю) міряють або потужність експозиційної дози γ-або рентгенівського випромінювання (в мілірентгенах на годину), або потік β-частинок з поверхні (кількість частинок в сек. На 1 см ^2). Власне поглинена працівником доза звичайно вимірюється спеціальними індивідуальними дозиметрами різних систем: іонізаційними - типу ДП-22В, фотокасетнимі (кількісна авторадіографія) і навіть сучасними термолюмінісцентнимі. Проте, всі виміри всіма типами дозиметрів завжди показували, що для працюючих в life science, поглинуті дози нескінченно малі і не можуть бути достовірно вимірюється існуючими приладами. Порядок роботи з радіоактивними речовинами визначено в ОСП. Остання редакція цього документа називається "Основні санітарні правила забезпечення радіаційної безпеки" (ОСПОРБ-99), і назва повністю відповідає змісту. У ОСПОРБ-99 не тільки докладно викладено порядок роботи з будь-якими радіонуклідами, а й порядок їх отримання (передачі) від інших організацій, порядок списання джерел і здачі радіоактивних відходів та багато іншого. Відповідно до класифікації робіт з радіоактивними речовинами в цьому документі в залежності від рівня небезпеки, всі дослідження з радіоактивними ізотопами life science відносяться до третього (самому низькому) класу радіаційної небезпеки. Ця "класність" робіт визначається, по-перше, кількістю радіонукліда на робочому місці, а по-друге, "радіотоксичність" радіонукліда і характером робіт щодо його використання. Радіотоксичність - поняття, введене для оцінки шкоди, яка може завдати радіонуклід людині, і залежить від типу розпаду, енергії випромінювання, періоду напіврозпаду і здатності радіонукліду засвоюватися організмом. Всі радіонукліди розбиті на чотири групи радіотоксичності: А (найнебезпечніша), Б, В, і Г (найменш небезпечна). З радіонуклідів, зазначених у таблиці 1, самим "шкідливим" є фосфор-32 - група Б. Небезпека радіонукліда при зовнішньому опроміненні визначається характером і енергією випромінювання. Для всіх "м'яких" β-випромінювачів (для life science радіонуклідів з таблиці 1: тритій, вуглецю-14, фосфор-33, і сірка-35) небезпека мінімальна. Електронний потік затримується листом щільного паперу, гумовими рукавичками хірургічними і т.д. Складніше з фосфором-32. Крім випромінювання високо енергетичних електронів для фосфору-32 характерно "гальмівне випромінювання" - вторинне електромагнітне випромінювання, що виникає при гальмуванні електрона в щільному середовищі. За своєю природою таке гальмівне випромінювання однаково з рентгенівським і його проникаюча здатність дуже висока. Саме з цієї причини для захисту від випромінювання фосфору-32 застосовуються додаткові засоби захисту: захисні екрани зі свинцевими стеклами і свинцеві контейнери для препаратів. Аналогічна захист потрібно і для роботи з йодом-125. Гамма-випромінювання ¹²⁵ I екранувати легкої захистом з оргскла не вдається. Існують три захисні фактора від впливу іонізуючого випромінювання на організм. 41. Відстань. Чим далі ви від джерела випромінювання, тим краще. Це не тільки виведення народної мудрості - "триматися подалі", а й науково обгрунтована реальність, тому що інтенсивність випромінювання зменшується пропорційно квадрату відстані. Тому намагайтеся не брати радіоактивні препарати руками (навіть у рукавичках), а користуйтеся пінцетами, захопленням та іншими дистанційними пристроями, якщо така можливість є. 42. Час. Чим менше час контакту з радіоактивною речовиною, тим менше шкоди впливу. Тому готуйте заздалегідь все реактиви, прилади, розрахунки і продумуйте свої дії, щоб скоротити час безпосереднього контакту з радіоактивною речовиною до мінімального. 43. Захисна середовище (екранування). Власне захист за допомогою різних контейнерів, стінок, екранів, захисного спецодягу, окулярів і т.д. Чомусь цього фактору приділяють найбільшу увагу, хоча перший і другий набагато важливіше і простіше. Дещо складніше ситуація з внутрішнім опроміненням. Зрозуміло, що внутрішнє опромінення можливе лише при попаданні радіонукліда всередину разом з їжею, водою або при вдиху. Так як таке попадання зазвичай не планується, то і оцінити кількість радіоактивного матеріалу і, відповідно, дозу внутрішнього опромінення дуже складно. Особливо це проблематично для слабких β-випромінювачів тритію або вуглецю-14. Тому головним способом зниження внутрішнього опромінення персоналу, що працює з радіонуклідами, є акуратність в роботі з відкритими джерелами і дотримання санітарних і гігієнічних норм і правил. Взагалі, всупереч різним чуткам, кількість радіоактивного матеріалу, що використовується для life science, не може завдати серйозного збитку для здоров'я людини, що працює безпосередньо з препаратом, і тим більше для його майбутніх дітей. Навіть якщо в повному божевіллі хтось проковтне 1ч2 повних фасування ^[γ-32 P] ATP (40 МБк), то збиток буде виражатися, як матеріальні втрати від нецільового використання препарату, але не від фізичної шкоди здоров'ю проковтнуло. За багаторічну роботу численних наукових співробітників у біологічних НДІ в СРСР, а потім у Росії, не зафіксовано жодного випадку негативного впливу радіоактивних препаратів на здоров'я працюючого співробітника. Занадто малі кількості радіоактивних препаратів застосовують для роботи по III-му класу робіт з радіоактивними речовинами. Однак, це не відноситься до робіт на підприємствах, що виробляють радіонукліди, і до інших організацій, де працюють з радіонуклідами по I або II класу робіт.

http://ua-referat.com

Радіоактивний вплив радіації на людину

Іонізуючі випромінювання існували на Землі ще задовго до появи на ній людини. Проте вплив іонізуючих випромінювань на організм людини був виявлений лише наприкінці XIX ст. з відкриттям французь­кого вченого А.Беккереля, а потім дослідженнями П'єраі Марії Кюрі явища радіоактивності.

Поняття «іонізуюче випромінювання» об'єднує різноманітні види, різні за своєю природою, випромінювання. Подібність їх полягає в тому, що усі вони відрізняються високою енергією, мають властивість іоні­зувати і руйнувати біологічні об'єкти.

Випромінювання характеризуються за своєю іонізуючою і проникаючою спро­можностями. Іонізуюча спроможність випромінювання визначається питомою іонізацією, тобто числом пар іонів, що утворюються частинкою в одиниці об'єму, маси середовища або на одиниці довжини шляху. Різноманітні види випромінювань мають різноманітну іонізуючу спроможність. Проникаюча спроможність випромінювань визначається розміром пробігу, тобто шляхом, пройденим часткою в речовині до її повного зникнення. Джерела іонізуючих випромінювань поділяються на при­родні та штучні (антропогенні).

Природні іонізуючі випромінювання

Основну частину опромінення населення земної кулі одержує від природних джерел випромінювань. Більшість з них такі, що уникнути опромінення від них неможливо. Протягом всієї історії існування Землі різні види випромінювання попадають на поверхню Землі з Космосу і надходять від радіоактивних речовин, що знаходяться у земній корі.

* Радіаційний фон, що утворюється космічними променями, дає менше половини зовнішнього опромінення, яке одержує населення від природних джерел радіації. Космічні промені переважно приходять до нас з глибин Всесвіту, але деяка певна їх частина народжується на Сонці під час сонячних спалахів. Космічні промені можуть досягати поверхні Землі або, взаємодіяти з її атмосферою, породжуючи повтор­не випромінювання і призводячи до утворення різноманітних радіо­нуклідів. Опромінення від природних джерел радіації зазнають усі жителі Землі, проте одні з них одержують більші дози, інші — менші.

Це залежить, зокрема, від того, де. вони живуть. Рівень радіації в дея­ких місцях залягання радіоактивних порід земної кулі значно вищий від середнього, а в інших місцях — відповідно нижчий. Доза опромі­нення залежить також і від способу життя людей.

За підрахунками наукового комітету по дії атомної радіації ООН, середня ефективна еквівалентна доза зовнішнього опромінення, яку людина одержує зарік від земних джерел природної радіації, становить приблизно 350мкЗв, тобто тро­хи більше середньої дози опромінення через радіаційний фон, що утворюється кос­мічними променями.

Людина зазнає опромінення двома способами — зовнішнім та внутрішнім. Якщо радіоактивні речовини знаходяться поза організ­мом і опромінюють його ззовні, то у цьому випадку говорять про зовнішнє опромінення. А якщо ж вони знаходяться у повітрі, яким дихає людина, або у їжі чи воді і потрапляють всередину організму через органи дихання та кишково-шлунковий тракт, то таке опромінення назива­ють внутрішнім.

Перед тим, як потрапити до організму людини, радіоактивні речо­вини проходять складний маршрут у навколишньому середовищі, і це необхідно враховувати при оцінці доз опромінення, отриманих від того чи іншого джерела.

Внутрішнє опромінення в середньому становить 2/3 ефективної еквівалентної дози опромінення, яку людина одержує від природних джерел радіації. Воно над­ходить від радіоактивних речовин, що потрапили в організм з їжею, водою чи повітрям. Невеличка частина цієї дози припадає на радіоактивні ізотопи (типу вуглець-14, тритій), що утворюються під впливом космічної радіації. Все інше надходить від джерел земного походження. В середньому людина одержує близько 180 мкЗв/рік за рахунок калію-40, який засвоюється організмом разом із нерадіоактивним ізотопом калію, що є необхідним для життєдіяльності людини. Проте значно більшу дозу внутрішнього опромінення людина одержує від нуклідів радіо­активного, ряду урану-238 і в меншій кількості від радіонуклідів ряду торію-232.