Тема: «Генеалогический метод исследования наследственности человека»

1. Основные методы изучения генетики человека.

2. Особенности клинико-генеалогического метода обследования больных с наследственной патологией.

3. Обозначения, принятые при составлении родословных. Составление и анализ родословных. Особенности при аутосомно-доминантная, аутосомно-рецесивная, сцепленные с полом типах наследования.

Основные методы изучения генетики человека.

Известны два типа близнецов: первый тип – монозиготные близнецы; второй – дизиготные близнецы. Монозиготные близнецы происходят из одной единой оплодотворенной яйцеклетки (зиготы), разделившейся на ранних стадиях развития на два изолированных эмбриона. Поскольку монозиготные близнецы происходят из одной оплодотворенной яйцеклетки, их иногда называют однояйцовыми близнецами. Дизиготные близнецы возникают в случаях двойной овуляции, когда каждая яйцеклетка оплодотворяется отдельным сперматозоидам. Именно поэтому дизиготных близнецов иногда называют двуяйцовыми близнецами. Дизиготные близнецы генетически сходны как два брата, или как две сестры, или как брат и сестра, т.е. они сходны между собой не более, чем братья и сестры, рожденные порознь. Монозиготные близнецы, поскольку они происходят из одной яйцеклетки, оплодотворенной одним сперматозоидом, всегда генетически идентичны. Эта характеристика монозиготных близнецов является важным условием не только для доказательства значения наследственных факторов в возникновении заболеваний, но и для оценки влияния наследственности и среды на формирование признака или возникновения заболевания. Различие между дизиготными близнецами по любому признаку могут возникать как в результате внешнесредовых воздействий, так и как следствие их генетических различий или комбинаций. Различия между монозиготными близнецами возникают только в результате воздействия внешних факторов, поскольку они генетически идентичны. Если возникновение признака в значительной степени зависит от генетической конституции, тогда у монозиготных близнецов совпадение наблюдается гораздо чаще, чем у дизиготных близнецов. И, наоборот, если участие генетических факторов в возникновении признака мало или несущественно, тогда частота похожести монозиготных близнецов не будет отличаться от частоты похожести дизиготных близнецов. Внутрипарное сходство близнецов в отношении какого-либо признака носит название конкордантности. Конкордантность определяется как процент случаев, когда оба близнеца одной пары имеют признаки. Если один близнец из пары имеет признак, а другой не имеет рассматриваемого признака, такие пары близнецов называются дискордантными.

Значение показателя конкордантности в значительной мере зависит от степени генетической детерминации признака и типа наследования. Если признак полностью определяется наследственными факторами, то конкордантность монозиготных близнецов будет 100%. Конкордантность дизиготных близнецов в данном случае зависит от типа наследования. Например, конкордантность дизиготных близнецов в случае аутосомно-доминантного типа наследования признака или болезни составит 50%; когда признак определяется рецессивным геном, пенетрантность составит 25% и т.д.

Цитогенетический метод. Изучение строения и функций хромосом привело к выделению самостоятельного раздела области науки – цитогенетики. Началом развития цитогенетики человека можно считать 50-60-е годы, когда впервые появились публикации работ, в которых удалось получить убедительные картины морфологии всех хромосом человека и правильно определить их диплоидное число.

Методы цитогенетического исследования можно условно подразделить на прямые и непрямые. Прямые методы – это методы получения препоратов делящихся клеток без культивирования. Непрямые методы – это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах. При обоих методах объектом цитогенетического исследования являются хромосомы в стадии метафазы, поскольку как уже говорилось выше, именно на этой стадии возможно точная идентификация хромосом и выявление их нарушений. Исследование хромосом в мейозе также возможно, однако у человека это связано с методическими трудностями в получении биоптатов из половых желез.

Прямые методы исследования позволяют проводить хромосомный анализ клеток опухолей, но в основном используются для изучения костного мозга.

Непрямые методы связаны с культивированием клеток. Наиболее простым и доступным методом в клинической цитогенетике является анализ хромосом лимфоцитов периферической крови человека на стадии метафазы.

Очень важным моментам для анализа хромосом является их окрашивание. Сплошное или равномерное окрашивание хромосом получило название рутинной окраски. Для рутинной окраски используют простые красители: азур-эозин или краситель Гимза.

Использование такого метода окрашивания позволяет провести подсчет хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждение хромосом, называемые хромосомными аберрациями. Однако этот метод имеет ограничения при кариотипировании, поскольку не дает возможности индивидуальной идентификации хромосом.

Для каждого из видов окраски разработаны многочисленные модификации технического выполнения этапов, в этих случаях применяется трехбуквенная система обозначения вида окраски.

Относительно недавно в арсенале лабораторной цитогенетики появились высокоразрешающие методы – молекулярно-цитогенетический метод гибридизации in situ, в частности флуоресцентная гибридизация in situ, или FISH-метод.

Метод гибридизация in situ основан на обработке препаратов хромосом специфическим ДНК-зондом, который присоединяется к исследуемой хромосоме, и, после обработки специальными соединениями и флуоресцентными красителями, препарат исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

Методы цитогенетической диагностики, применяемые в клинической генетике, часто используются в комплекте с другими методиками лабораторной диагностики, дополняя друг друга. Это позволяет более точно диагностировать сложные проявления наследственных и врожденных заболеваний человека. В нашей стране, как и во всем мире, цитогенетические методы прочно вошли в арсенал необходимых диагностических процедур для решения сложных дифференциально-диагностических задач практически во всех областях медицины. Особое значение эти методы имеют при оказании помощи больным педиатрического, акушерско-гинекологического и эндокринологического профилей. Все вопросы назначения того или иного цитогенетического исследования осуществляются при медико-генетическом консультировании. В целом же, все практические проблемы, решаемы лабораторными цитогенетическими методами, можно свести к следующим

- подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике;

- наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому;

- многократные спонтанные аборты, мертворождения или рождение детей с врожденными пороками развития;

- нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин;

- существенная задержка умственного и физического развития ребенка;

- пренатальная диагностика;

- подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью;

- лейкозы;

- оценка мутагенных воздействий.

Участие цитогенетиков в анализе трудных с диагностической точки зрения случаев часто приводит к более точной диагностике и, соответственно, к своевременному лечению и предупреждению рождения больного ребенка.

Биохимические методы. Биохимические показатели отражают сущность наследственной болезни точнее, чем клиническая симптоматика. При биохимической диагностике оценивается фенотип организма на молекулярном уровне, а наследственная болезнь в конечном счете и есть фенотип. Поэтому биохимическим методам принадлежит ведущая роль в диагностике многих моногенных болезней. Однако сложность диагностики заключается в том, что сотни наследственных болезней по некоторым биохимическим показателем мочи или крови могут быть сходными. Определять для каждого больного многие метаболиты очень трудоемко и дорого. Знание общих характеристик изменений обмена веществ при разных наследственных болезнях позволило по-новому построить исходную схему обследования, исходя из клинической картины болезни, генетических сведений м плана биохимического анализа. Такой подход позволяет проводить обследование на основе поэтапного исключения определенных классов болезней.

В биохимической диагностике наследственных болезней используются как классические биохимические методы, так и современные высокоточные технологии, такие как жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитно-резонансная спектрометрия, бомбардировка быстрыми нейтронами. Биохимическое обследование пациента позволяет идентифицировать любые метаболиты, специфические для той наследственной болезни, с подозрением на которую он был направлен. Каждое обследование должно начинаться с составления плана, в основе которого лежит клинико-генетическая информация о пациенте и его семье. «Объектами» биохимической диагностики является биологические жидкости: моча, пот, плазма и сыворотка крови, эритроциты, лейкоциты, культуры фибробластов, лимфоцитов.

Биохимическая диагностика начинается с просеивающего подхода, в котором выделяют два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из этих уровней может быть более или менее полным в зависимости от оснащенности лаборатории.

Основной целью первичного уровня диагностики является исключение здоровых индивидов из дальнейшего обследования. Различают два вида программ первичной биохимической диагностики: массовые и селективные. На первом этапе в таких программах используется моча и кровь.

Первый этап программы включает качественный и количественный анализ мочи и крови (14 тестов): на белок, на кетокислоты, на цистин и гомоцистин, креатинин ионы аммония и др. Второй этап основан на методах тонкослойной хроматографии мочи и крови для выявления аминокислот, фенольных кислот, моно- и дисахаридов и других соединений. С помощью электрофореза мочи выявляют гликозаминогликаны. Эта программа позволяет выявлять 140 наследственных болезней обмена веществ у детей из следующих основных классов:

аминоацидопатии;

органические ацидурии;

лизосомные болезни накопления;

болезни углеводного обмена;

болезни обменов металлов;

болезни пуринового и пиримидинового обмена;

наследственные болезни метаболического транспорта;

наследственные болезни желудочно-кишечного тракта;

наследственные болезни нейротрансмиттерного обмена;

наследственная болезнь обмена витаминов;

митохондриальные болезни;

болезни β-окисления жирных кислот;

пероксисомные болезни.

Важность такой программы в детских больницах трудно переоценить.

Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях при подозрении на наследственные болезни обмена веществ.

Молекулярно-генетические методы. Молекулярно-генетические методы предназначены для выявления особенностей в структуре ДНК. В основе анализа ДНК лежит две ее характеристики как носителя генетической информации:

- последовательность составляющих ДНК элементов имеет индивидуальные особенности у каждого отдельного человека, кроме идентичных близнецов или клонированных организмов;

- у каждого человека во всех соматических клетках структура ДНК совершенно одинакова.

ДНК может быть выделена из любого типа тканей или клеток организма, содержащих ядра. Чаще всего для получения образцов ДНК используют лейкоциты периферической крови и клетки ворсин хориона.

Полимеразная цепная реакция – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить и многократно копировать с помощью термостабильной ДНК-полимеразы определенный фрагмент ДНК. В основе метода лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из трех последовательных этапов. Первый этап состоит в денатурации искомой нуклеиновой кислоты, достигаемой повышением температуры до 70-80^° С, после чего нуклеиновая кислота присутствует в растворе в виде отдельных цепей. Если искомой нуклеиновой кислоты является РНК, то она предварительно переводится в ДНК методом обратной транскрипции. На втором этапе к определенному участку каждой из противоположных цепей присоединяются праймеры – короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Для осуществления этого присоединения температура среды понижается до 37-40^° С. На завершающим третьем этапе происходит синтез новых цепей при участии фермента – термостабильной ДНК полимеразы, поскольку этот этап, как и первой, протекает при высокой температуре. Через три цикла устанавливается стабильная амплификация фрагмента, соответствующего нуклеотидной последовательности между двумя праймерами. Конечная продукция составляет 2^п копий фрагмента, где п – число циклов. Специальный прибор (сайклер) позволяет быстро менять температуру реагирующей смеси. В этих условиях постоянно удается получать концентрацию фрагмента, превышающую исходную в миллион раз. В дальнейшем продукт ПЦР подвергается электрофорезу и анализу. ПЦР эффективно используется в дородовой диагностике: достаточно небольшого объема материала ворсин хориона или других клеток плода, и в течение двух дней можно дать ответ о наличии у будущего ребенка мутантного аллеля в гомо- или герерозиготном наборе. Осуществление таких процедут на ранних сроках беременности позволяет врачам принять решение о ведении беременности, коррекции дефекта, подготовки семьи к ожидаемому событию.

Молекулярно-генетические методы используют при диагностике более 300 наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатиях, митохондриальных болезней, муковисцидозе, фенилкетонурии, миопатии Дюшенна и др. Их число постоянно растет. Кроме того, ДНК-технологии находят применение: в исследованиях для определения происхождения популяций людей; в практике судебной медицины; для определения отцовства или степени родства; для генетического анализа клеток костного мозга при его трансплантации от донора реципиенту; для определения мутаций, при диагностике наследственных болезней и для расшифровки генома человека.