Нейральные индукторы-активаторы

Естественные нейрализующие факторы шпеманновского "органи­затора" относятся к разряду секретируемых и способных к диффузии сигнальных молекул. Наиболее четко это было продемонстрировано группой финских исследователей при участии Лаури Саксена и Суло Тойвонена (Sulo Toivonen) в изящных экспериментах по разделению эк­тодермы и "организатора" (дорсальная губа бластопора) тритонов фильтрами разной толщины и с различным размером пор (так называ­емая "трансфильтровая" нейральная индукция). После нескольких ча­сов "трансфильтрового контакта" эктодермальные эксплантаты отде­ляли от фильтров и культивировали отдельно; при последующем гисто­логическом анализе в них были обнаружены типичные передне-голов­ные комплексы (рис. 3.3).

Кандидаты на роль естественных нейрализующих агентов должны отвечать, по крайней мере, двум требованиям: они должны экспресси-роваться в шпеманновском "организаторе" и относиться к секретируемым белкам, способным к диффузии.

Одним из первых таких белков оказался секретируемый полипептид ноггин (noggin). Ген ноггина экспрессируется в шпеманновском "организаторе" и изначально предпола­галось, что ноггин принимает участие в регионализации мезодермального пласта, способствуя формированию хорды. Ме­ханизм действия ноггина пока неизвестен. Правда, показано, что два ге­на-мишени ноггина {downstream target genes), а именно otx 2 и XIPou 2, участвуют в процессах нейрализации эктодермы шпорцевой лягушки.

Следующим кандидатом на роль нейрального индуктора оказался полипептидный фактор фоллистатин (follistatin). Ранее фоллистатин был идентифицирован у млекопитающих как секреторный белок, кото­рый блокирует способность иного фактора, активина (activin), стимули­ровать высвобождение фолликул-стимулирующего гормона. Связыва­ние и инактивация активина - основная функция фоллистатина на про­двинутых стадиях эмбрионального развития и во взрослом состоянии. Вместе с тем у ранних зародышей амфибий этот фактор участвует в процессах нейральной индукции. Показано, что фоллистатин экспрессируется в шпеманновском "организаторе" и, подобно ноггину, инъек­ция мРНК фоллистатина в зародыши амфибий вызывает нейрализацию эмбриональной эктодермы, причем эффект является дозово-зависимым. Интересно, что активин также секретируется "организатором" ам­фибий и в низких концентрациях способен поддерживать эпидермальную дифференцировку эмбриональной эктодермы. Это навело на мысль, что нейрализующее действие фоллистатина является непря­мым: связываясь с активином, фоллистатин тем самым ингибирует эпидермальную дифференцировку, что является од­ним из условий начала нейрализации эктодермы гаструлы амфибий.

Очень перспективные данные были получены при исследовании свойств еще одного секретируемого полипептида, названного хордин (chordin). Хордин также экспрессируется в шпеманновском "организаторе". В нормальном развитии хордин впервые обнаруживает­ся в презумптивном "организаторе" на стадии поздней бластулы, где и продолжает экспрессироваться в процессе гаструляции. На более позд­них стадиях развития его экспрессия ограничивается хордой (отсюда и название фактора). Инъекция мРНК хордина в вентральную область бластулы амфибий приводит к формированию вторичного осевого ком­плекса. Добавление высокоочищенного белка хордина к культивируемым эктодермальным эксплантатам эктодермы гаструлы проводит к выраженным нейрализующим эффектам.

Активин принадлежит к суперсемейству так называемых "транс­формирующих факторов роста" (Transforming Growth Factors - TGFs). Вместе с тем, другие члены этого суперсемейства, так называемые "морфогенетические факторы кости" (Bone Morphogenetic Proteins -BMPs), проявляют свойства эпидермальных индукторов. У шпорцевой лягушки Xenopus эктодермальные клетки имеют естественную тенденцию дифференцироваться в нервную ткань, но ингибируются под влиянием BMP-сигналов. Хордин, ноггин и фолистатин являются эндогенными антогонистами BMP, связываются с ним непосредственно, и блокируют его действие, открывая возможность нейрализации эктодермы.

У амфибий регуляция нейрализующей активности хордина находится под контролем металлопротеаз. Одна из них, а именно секретируемая металлопротеаза Xolloid отменяет нейрализующую активность хордина, но не ноггина или фоллистатина. Хордин, обработанный Xolloid, утрачивает способность связываться с BMPs. Таким образом, на примере хордина можно видеть, сколь сложным может оказаться меха­низм действия нейрализующих агентов в зародыше.

Вторым после хордина геном, наиболее представленным среди дорзо-специфичных кДНК последовательностей шпеманновского "органи­затора", оказался ген, названный церберус (cerberus; по кличке мифо­логического трехголового пса Цербера, охранявшего вход в подземное царство). Соответствующая церберусу кДНК кодирует секреторный полипептид из 270 аминокислотных остатков, не имеющий существен­ной гомологии с известными белками. Введение в ранние зародыши ам­фибий мРНК церберуса приводит к эктопическому образованию но­вых, дополнительных голов (отсюда и название фактора!), каждая из которых содержит ткань переднего-среднего мозга, циклопический глаз и обонятельные клетки. В нормальном развитии амфибий церберус экспрессируется в наиболее глубоких слоях "организатора" и его транскрипция активируется фоллистатином, хордином и ноггином.

Еще несколько ростовых факторов млекопитающих, идентифици­рованных в шпеманновском "организаторе", способны нейрализовать эктодерму ранней гаструлы амфибий. Один из них, Хnr3, относится к семейству так называемых "трансформирующих факторов роста" (Transforming Growth Factors - TGFs); он образует с BMPs гетеродимеры, лишенные функцио­нальной активности. Интересно, что любые иные экспериментальные воздействия, нарушающие передачу BMP-сигналов в пределах эктодер­мы, приводят к нейрализации ее клеток.

Два других фактора (FGF 3 и FGF 4) принадлежат к семейству факторов роста фибробластов. Эти факторы скорее действуют в совокупности с другими нейрализующими агентами шпе­манновского "организатора", приводя к аддитивному положительному эффекту.

Не только секретируемые "организатором" сигнальные полипепти­ды-эффекторы, но и некоторые гомеобокс-содержащие гены также иг­рают значительную роль в нейральной индукции. Один из таких генов (ХНт-1), относящийся к LIM-семейству гомеобокс-содержащих генов, экспрессируется в Шпеманновском "организаторе", и введение зароды­шам его мРНК вызывает индукцию синтеза нейроспецифических транскриптов в эктодерме гаструлы. Более того, ХНт-1 инициирует экспрессию хордина, но не ноггина и фоллистатина, что указывает на определенные различия в регуляции синтеза этих трех нейральных ин­дукторов в нормальном развитии амфибий.

Очевидно, что и на молекулярном уров­не нейральная индукция - не одномоментная акция, а многоступенча­тый процесс, в котором участвуют несколько сигнальных агентов-акти­ваторов, синтезируемых шпеманновским "организатором". Эти сиг­нальные молекулы различаются по своей структуре, свойствам и меха­низмам действия на эктодермальные клетки-мишени. Иначе говоря, нейральные активаторы не являются семейством родственных факто­ров. Напротив, каждый из них характеризуется своим, подчас весьма специфическим механизмом действия, и вызываемый ими конечный сходный эффект (т.е. нейрализация эктодермальных клеток) зависит от многих других факторов и условий.

Оказалось, что выбор эктодермой нейрального управления дифференцировки представляет собой результат антагонистических взаимодействий между активаторами и ингибиторами. Под последними подразумеваются полипептидные сигнальные молекулы, синтезируемые как шпеманновским «организатором», так и реагирующей эктодермой ранней гаструлы амфибий, которые препятствуют нейрализации в нормальном развитии.

Нейральная индукция: молекулы-ингибиторы

Эффекты дезагрегации-реагрегации эктодермалъных эксплантатов

Провоцирующим моментом в поисках естественных нейральных ингибиторов послужили опыты по изучению влияния диссоциации ку­сочков эктодермы ранней гаструлы амфибий на дифференцировочную судьбу изолированных клеток. Несколько научных коллективов продемонстрировали неизвестный ранее феномен: дезаг­регация эктодермы приводит, без каких-либо дополнительных внешних воздействий, к превращению изолированных клеток в нейроны, что со­провождается активацией нейроспецифичцых генов и типичными стру­ктурными изменениями.

Было показано, что и вентральная и дорзальная облас­ти эктодермы содержат клетки, способные после нарушения клеточ­ных контактов изменять эпидермальное направление дифференциров­ки и вставать на путь нейрального развития. Также оказалось, что концентрированные среды из-под эктодермальных клеточных суспен­зий ингибируют нейрализацию целых фрагментов эктодермы, совме­щенной in vitro с дорзальной губой бластопора (шпеманновский "орга­низатор").

Хотя соответствующие ингибиторы не идентифицированы, очевид­но, что они являются естественными компонентами эктодермы гаструлы амфибий. Последнее указывает на то, что процесс нейральной ин­дукции в нормальном развитии находится, возможно, под негативным контролем эндогенных эктодермальных ингибиторов, которые инактивируют нейрализующие сигналы, поступающие в эктодерму от шпеманновского "организатора". В отсутствие нейрализующих воздейст­вий эти эндогенные ингибиторы, возможно, играют иную роль: стаби­лизируют или поддерживают эпидермальное направление дифференцировки клеток эктодермы.