Работа 2. Определение содержания мочевины в сыворотке крови ферментативным методом. Принцип метода

Уреаза гидролизует мочевину с образованием аммиака и двуокиси углерода. Аммиак реагирует с производными фенола и щелочным раствором гипохлорита с образованием цветного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в анализируемой пробе.

Реактивы. Рабочий раствор - уреаза, нитропруссид натрия+буферно-субстратный раствор рН 6,5. Реактив 3 - раствор гипохлорита натрия и гидроокиси натрия.

Ход определения

	Опытная проба	Холостая проба
Сыворотка крови, мл	0,02	-
Рабочий раствор, мл	2,0	2,0
Перемешать и инкубировать 10 мин при 370 С
Реактив 3, мл	2,0	2,0

Перемешать, выдержать 15 мин при комнатной температуре. Инкубационную смесь следует предохранять от воздействия прямого света. После инкубации измеряют оптическую плотность опытной (А) пробы против холостой пробы в кюветах на 10 мм при длине волны 670 нм на ФЭКе.

Расчет концентрации мочевины в опытной пробе проводят по формуле: С = (А/0,21)·10 ммоль/л. В норме – 3,5-9,0 ммоль/л.

Эталоны ответов на тесты

1.1. – 4

1.2. – 1

2.1. – 1-Б, 2-Г, 3-В

2.2. – 1-В; 2-А,Б; 3-А; 4-Б

3.1. – 1,2,3

3.2. – 1,2,3

4.1. – А (+ + +)

4.2. – В (+ + -)

Эталоны ответов на ситуационные задачи Задача 1.

Аспарагиновая кислота может вступать в реакцию переаминирования, однако отсутствие кетокислот исключает эту возможность. Следует вспомнить роль аспарагиновой кислоты в биосинтезе мочевины и проследить судьбу углеродсодержащего остатка: найти в схеме биосинтеза мочевины конечный продукт орнитинового цикла, углеродный скелет которого принадлежит аспарагиновой кислоте, – он и будет содержать метку.

Задача 2.

СО₂ утилизируется печеночной тканью главным образом для синтеза мочевины через карбамоилфосфат. Проследите судьбу этого атома углерода в орнитиновом цикле и назовите все продукты, в состав которых последовательно войдет метка (последний из них - мочевина).

Занятие 35. Специфические пути метаболизма отдельных аминокислот.

Цель занятия. Усвоить пути метаболизма отдельных аминокислот в тканях.

Содержание занятия:

– контроль выполнения заданий по самоподготовке;

– выполнение заданий тестового контроля;

– выполнение практической работы по определению фенилпировиноградной кислоты в моче;

– участие в выступлении и обсуждении реферативных сообщений;

– контроль усвоения темы путем устного собеседования с преподавателем.

– качественное определение в моче фенилпировиноградной кислоты.

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1. Биосинтез аминокислот, образующихся из щавелевоуксусной, пировиноградной и α-кетоглутаровой кислот у E. coli.

2. Биосинтез ароматических аминокислот у микроорганизмов.