Работа 2. Определение активности пепсина и уропепсина. Принцип метода

Метод основан на способности пепсина в определенных условиях расщеплять в белковой молекуле гемоглобина пептидные связи, образованные тирозином, фенилаланином и триптофаном. По концентрации последних судят о пептической активности желудочного сока или мочи. Около 2 % пепсиногена, вырабатываемого клетками слизистой оболочкой желудка, поступает в кровь и выводится почками с мочой в виде уропепсиногена.

Ход определения активности уропепсина

Из суточного количества мочи отбирают 20 мл, помещают в градуированный цилиндр, подкисляют раствором соляной кислоты до рН 1,5 и доводят дистиллированной водой до 25 мл. Таким же путем доводят раствор гемоглобина до рН 1,5. В пробирку отмеривают 1 мл подкисленной мочи, добавляют 5 мл 1% раствора гемоглобина и выдерживают на водяной бане при 37° в течение 30 мин. Затем добавляют 10 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, фильтруют и в фильтрате определяют ароматические аминокислоты. Для этого к 2 мл фильтрата добавляют 5 мл дистиллированной воды, 8 мл раствора щелочи и 3 мл реактива Фолина, предварительно разведенного водой в 3 раза. После добавления последнего развивается голубая окраска. Через 30 мин, на фотоэлектроколориметре определяют оптическую плотность при длине волны 580 нм. Опыт сравнивают с контролем.

Расчет

Содержание пепсиногена в суточном количестве мочи производят по формуле:

П_сут. = 20хДхVхХ (Ед/24 часа),

где Д — оптическая плотность исследуемой мочи; Х - количество тирозина в мг, которое определено по калибровочной кривой; V - объем мочи за 24 часа.

Определение активности пепсина в желудочном соке.

Производят аналогичным способом, с той лишь разницей, что для исследования берут 0,5 мл желудочного сока. Расчет производят на 100 мл желудочного сока.

Работа 3. Количественное определение активности

уропепсина в моче по видоизмененному методу Веста.

В норме активность фермента составляет около 15-40 единиц. Определение содержания уропепсина имеет большое диагностическое значение, так как уровень выделения уропепсина отражает состояние секреторной функции желудка и изменяется параллельно с изменением кислотности желудочного сока. Увеличение активности уропепсина наблюдается при гиперацидном гастрите, язвенной болезни желудка; уменьшение – при гипоацидных гастритах, раке желудка, а также при заболеваниях желчных путей.

Принцип метода

Активированный в течение часа при 37°С соляной кислотой пепсиноген мочи (уропепсин) свертывает казеин молока. Активность уропепсина измеряется временем, необходимым для свертывания казеина. Мочу для исследования собирают за сутки или за определенный промежуток времени (2-3 часа).

Ход определения

В пробирку поместить 3,8 мл мочи, прибавить 0,2 мл 2 н. раствора НС1 и 1-2 капли 0,2 % раствора метилоранжа. Пробирку поместить в термостат при температуре 37°С на 1 час. По истечении указанного времени в пробирку быстро прилить 0,5 мл молочно-ацетатной смеси (к свежему коровьему молоку приливают равный объем ацетатного буфера, рН смеси равен 5,0). По секундомеру отметить время выпадения первых хлопьев.

Расчет

Активность уропепсина рассчитывается по формуле:

Х(Ед/час) = 10 × V

V_i × S × t

где V-весь объем мочи за данный промежуток времени; V_i-количество мочи, взятое для исследования; t-время, за которое была собрана вся моча; S-время свертывания молока.

Пример расчета:

В течение 3 часов (t=3) у больного было собрано 140 мл мочи (V=140). Для анализа было использовано 3,8 мл мочи (V_i=3,8).

Первые хлопья казеина появились через 8 сек. после добавления молочно-ацетатной смеси (S=8).

Рассчитываем по формуле активность уропепсина:

Х = (10 × 140) / (3,8 × 8 × 3) = 15,3 Ед/час

Работа 4. Количественное определение протеолитической

активности желудочного сока по Ансену.

Принцип метода

О протеолитической активности желудочного сока судят по количеству образующихся при расщеплении казеина неосаждаемых трихлоруксусной кислотой пептидов, количество которых соответствует количеству определяемого в них ароматических кислот.

Ход определения

В две центрифужные пробирки отмерить по 1 мл желудочного сока, разведенного в 10 раз. В опытную пробирку добавить 1,0 мл 5 % раствора казеината натрия, а в контрольную - 2,0 мл 5 % ТХУ. Содержимое пробирок перемешать, поместить в термостат при температуре 38° С на 20 мин. После термостатирования в контрольную пробу добавить 1 мл 5 % раствора казеината натрия, в опытную - 2,0 мл 5 % ТХУ. Выдержать 15 мин. Далее центрифугировать 15 мин при 3000 об/мин. После этого отобрать в 2 биологические пробирки по 1 мл центрифугата (надосадочной жидкости) и по 5 мл 0,5 н раствора Nа₂СО₃. При перемешивании в обе пробирки добавить по 1 мл реактива Фолина и выдержать 20 мин. Оптическую плотность опытного раствора измерить на ФЭКе при длине волны 760 нм (красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Концентрацию ароматических кислот (С_.) найти по калибровочному графику.

Протеолитическую активность определяют по формуле:

А=2С (мкМ/мл мин)

В норме протеолитическая активность желудочного сока равна 0,15-0,5 мкМ/мл мин.