Принцип метода

Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде, образуя 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты желто-оранжевого цвета, интенсивность окрашивания которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты (рис.). Гидразоны α-кетоглутаровой, щавелевоуксусной, дегидроаскорбиновой кислот в щелочной среде нестойки и быстро разлагаются.

Ход работы

Контрольная и опытная пробы ставятся одновременно, пользуются сухой химпосудой. Берут 2 пробирки: в контрольную наливают 1мл воды в опытную 1 мл мочи. Зачем в обе пробирки приливают по 1 мл 2,5% спиртового раствора КОН, перемешивают в течение 1 минуты, а затем приливают по 0,5мл 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина и оставляют стоять на 15 минут при комнатной температуре.

Колориметрируют на ФЭК против контроля на реактивы (проба с водой) в кювете толщиной 5мм с синим светофильтром.

Расчеты выполняют по калибровочному графику, при этом находим содержание ПВК в моче в мкг/мл. Найденную величину умножаем на суточный диурез (1500 мл для мужчин и 1200 мл для женщин) и получаем содержание ПВК в суточной моче. В норме экскреция ПВК с мочой составляет 10-25 мг в сутки (113,7-283,9 мкммоль/сут).

Увеличение выделения ПВК с мочой наблюдается при авитаминозе и гиповитаминозе В_1, т.к. в крови и других тканях, особенно в мозге, накапливается большое ее количество. Содержание ПВК в крови и экскреция с мочой возрастает также при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы. При наркозе содержание ПВК в крови, напротив, снижается.

Работа 2. Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц.

Сукцинатдегидрогеназа окисляет янтарную кислоту в фумаровую. Коферментом СДГ является флавинадениндинуклеотид. В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола.

В водном растворе окисленная форма 2,6-дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет, восстановленная форма - бесцветна. Активность СДГ мышц определяется при добавлении к мышечной кашице растворов сукцината и натриевой соли окисленной формы 2,6-дихлорфенолиндифенола. Если СДГ активна, то интенсивность синей окраски ослабляется благодаря восстановлению красителя.

Ход работы

В 2 пробирки отмерить по 3мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку добавить 5 капель 5% раствора янтарной кислоты и для нейтрализации 5 капель 0.1нраствора едкого калия, в другую прилить 10 капель дистиллированной воды. В обе добавить по 1мл 0,001н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной ткани поперечнополосатой мышечной ткани только что убитого животного. Обе пробирки поместить в термостат на 20 минут при 37С. Затем сравнить интенсивность окраски в контрольной и опытной пробирках.

Химизм реакции:

сукцинат окисленная форма фумарат восстановленная форма

2,6-дихлорфенолиндофенола 2,6-дихлорфенолиндофенола

Работа 3. Определение активности пероксидазы в растительном

материале по методу А. Н. Бояркина.

Принцип метода

Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы. Реакция описывается уравнением:

Ход работы

Навеску 100 мг растительного материала (свежие листья растений) помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, а затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Ставят кюветы в кюветодержатель прибора: слева контрольную и справа опытную. Шкалу правого отсчетного барабана устанавливают на нулевую отметку и с помощью оптических клиньев приводят стрелку гальванометра в нулевое положение.

Правый отсчетный барабан ставят на деление 0,250 (исходная экстинкция), при этом стрелка гальванометра отклоняется в сторону.

В левую (контрольную) кювету добавляют 2 мл воды, а в правую (опытную) вносят 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете). Одновременно с первой каплей жидкости включают секундомер.

В опытной кювете раствор синеет, по мере нарастания интенсивности окраски, стрелка гальванометра приближается к нулевому положению. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра нулевого положения. Повторяют определения трижды и берут среднее значение времени.