Занятие 4 «Ферменты» (часть 2)

1. Зависимость скорости ферментативной реакции. Действие факторов окружающей среды (температура, рН).

2. Коферменты, кофакторы, их роль в ферментативном катализе.

3. Кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен.

4. Регуляция ферментативной активности: ингибирование и активация. Определение параметров ферментативной реакции и вида ингибирования с использованием графической интерпретации уравнения Лайндивера-Берка.

5. Органоспецифичность ферментов. Изоферменты. Антиферменты. Энзимопатия. Применение ферментов в медицине.

Лабораторная работа №4.

Тема: «Влияние рН на активность амилазы слюны».

Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с раствором йода в течение времени. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки оптимального рН в кислую или щелочную зону расщепление крахмала произойдет только частично до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).

Ход работы.

1. Перед началом работы готовят раствор амилазы и определяют ее активность. Для этого смешивают 1 мл раствора крахмала и 0,5 мл разбавленной 1:10 слюны. Через каждые 2 минуты отбирают по 1 капле этой смеси и смешивают ее с каплей раствора йода на предметном стекле. Крахмал должен полностью расщепляться приблизительно за 10 минут (появляется желтая окраска при пробе с йодом). Если расщепление происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2, 3 или 4 раза.

2. В восемь пронумерованных пробирок добавляют по 2 мл фосфатного буфера с различным рН (от 5,4 до 8,0).

№ пробы	1	2	3	4	5	6	7	8
рН	5,5	5,9	6,2	6,6	6,8	7,1	7,3	8,0

Следует помнить, что при отмеривании разных буферных растворов нельзя пользоваться одной пипеткой. Необходимо использовать каждый раз чистую пипетку (или наливать из бюретки).

3. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл приготовленного раствора слюны ( разбавленного в зависимости от активности амилазы 1:10; 1:20; 1:50) и оставляют стоять в штативе на столе в течение 10 мин.

4. Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин. до тех пор, пока проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с первой пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают.

Сравнивая между собой окрашивание во всех пробирках, делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении рН среды.

Оформление работы: Результаты вносят в таблицу:

№ пробы	1	2	3	4	5	6	7	8
рН	5,5	5,9	6,2	6,6	6,8	7,1	7,3	8,0
окрашивание йодом

Делают вывод о характере влияния рН на активность амилазы. Отмечают оптимальное рН для действия амилазы.