Опыт 1. Разделение альбуминов и глобулинов методом высаливания.

Альбумины и глобулины являются наиболее распространенными в природных объектах простыми белками. Обычно они встречаются вместе и отделение их друг от друга основано на различной растворимости в воде и способности альбуминов и глобулинов осаждаться при различной концентрации солей.

Альбумины, как более мелкие и легкие, хорошо растворимы в воде и в концентрированных растворах солей. Они осаждаются лишь при более чем 50%-ном насыщении раствора солью.

В отличие от альбуминов глобулины не растворяются в воде, растворимы только в растворах солей средней концентрации (8-15%). Глобулины, как более крупные и тяжелые, выпадают в осадок при меньшем насыщении раствора солями.

В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция белка осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Через 5 минут осадок отфильтровывают и на фильтре остается глобулиновая фракция, а в фильтрате - альбуминовая. Осадок с фильтра снимают стеклянной палочкой и переносят в пробирку и добавляют 5 капель воды. Осадок растворяется.

Докажите наличие в растворе белка с помощью биуретовой реакции.

В пробирку с фильтратом добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения раствора, т.е. до тех пор, пока не прекратится растворение соли. При этом выпадает осадок – альбумины. Осадок отфильтровывают, растворяют и проводят биуретовую реакцию.

Объясните результаты опыта.

Необратимая коагуляция (денатурация белков).

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими своих нативных свойств. Такие изменения в большинстве случаев являются необратимыми или малообратимыми и называются денатурацией белков.

Денатурация белков может происходить под влиянием высоких температур, под действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солей тяжелых металлов и т.д.

Опыт 2. Коагуляция белков при кипячении.

Коагуляция белков может вызываться повышением температуры. При этом разрушается гидратная оболочка молекулы белка и изменяется ее структура. Вследствие этого белок теряет свою гидрофильность и при нагревании свыше 50-60^оС денатурируется.

Температурная коагуляция белка, находящегося в изоэлектрической точке (заряд молекулы белка равен нулю), усиливается, поскольку при этом частицы белка становятся наименее устойчивыми.

Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, так как его частицы перезаряжаются и имеют в первом случае положительный, а во втором – отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

В четыре пронумерованные пробирки наливают по 10 капель1%-ного раствора яичного белка.

1) Первую пробирку нагревают до кипения, при этом раствор белка мутнеет, но так как частицы денатурированного белка несут заряд, то они в осадок не выпадают.

Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (изоэлектрическая точка его 4,8) и в нейтральной среде он заряжен отрицательно.

2) Во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Белок выпадает в осадок, так как его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе).

3) В третью пробирку добавляют 1 каплю 10%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, так как в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе).

4) В четвертую пробирку добавляют 1 каплю 10%-ного раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд частиц белка увеличивается.