15. Структура, физико-химические и физиологи­ческие свойства панкреатической рибонуклеазы из коровьего молока.

Из коровьего молока выделена в 1962 году Бигхамом Е. и Зиттлом С. Рибонуклеаза коровь­его молока представлена двумя ти­пами: А и Б, активность которых составляет соответственно 90 и 10 % от общей РНКазной активности. Риб. А низкомолекулярный белок (молекулярная масса 13700 Да). Молекула состоит из 124 аминокислот . РНКаза Б по АК составу идентична РНКазе А, но является гликопротеином. В молекуле РНКазы Б содер­жится 2,2 % глюкозамина и 5,7 % ман­нозы. В состав активного центра риб. входят лизин и гистидин. РНКаза специфично катали­зирует фосфодиэфирные связи полинук­леотидов. Субстраты панкреатиче­ской РНКазы А и Б природные РНК, которые распадаются с образованием 3'-нуклеотидов, преимущественно с высвобождением пирими­диновых оснований. РНКаза гидроли­зует также 2',3'-циклические нуклеотиды цити­дина и уридина. Полиурацил распадается до отдельных единиц. Оптимум ферментатив­ной реакции: рН 7,5, температура 37 °С. Инги­биторы :Cu. Pb. Zn. др

РНКаза – щелоч. белок. изоэлектрич. точка рН 7,8. Кристал. РНКаза резистентна к высо­ким t и низким значениям рН. Она стабильна при нагревании до 90 °С в интервалах рН 2-4,5, но инактивируется при высоких знач.рН. Концентрация РНКаз в молоке различных млекопитающих значительно колеблется. Наи­более высокое в молоке коров (в среднем 2,5 мг%). Уровень рибонуклеаз в молоке зави­сит от стадии лактации. В коровьем мо­локе наиболее высокое их содержание отмеча­ется в первые сутки молозивного пе­риода. В стародойном молоке уровень РНКаз, по сравнению с основным периодом, не­сколько повышен, что находится в соответст­вии с динамикой изменения в период лакта­ции уровня тотального белка.

Источники риб. в мол.: молочная железа, сыво­ротка крови, содержащиеся в молоке клеточные элементы. У млекопитающих источ­ник может разтличаться. В кор.мол.- сыворотка крови, так как по характеристикам бычья сывороточная и молочная РНКазы иден­тичны.

Рибонуклеазы участвуют в формировании специф. и неспециф. иммунитета. Под влия­нием РНКаз повышается, антибактериальная резистентность мышей. Полагают, что рибон. действует совместно с лизоцимом, который повреждает структурные элементы клеточной стенки патогенных м.о., а РНКаза далее разру­шает клеточные РНК. Известно, что эндо­генные рибон. участвуют в противовирус­ной защите орга­низма,способствуют разрушению опухолевых клеток. Есть данные что экзогенные РНКазы вызывают увелич. в орг-ме эндогенных ри­бон., участвующих в формировании иммуни­тета. Панкреат. РНКаза является не только стимулятором гуморального и некоторых форм клеточного иммунитета, но также и неспе­цифических факторов защиты орга­низма. В мол. Рибон. могут гидролизовать РНК микросом. Так как РНК служит связую­щим компонентом для других микросомных комп.,то возможна активация некоторых фер­ментов. разрушение РНК микросом шариков жира может сказываться на стабильности жиро­вой фазы молока. Рибон., попадающая в орг. с мол.,-белок с малой молек. массой, хо­рошо проникает и задерживается. Он один из факторов, уч-их в иммунитете орг-ма в постна­тальный период. Для новорожд, практ без иммун. роль поступающих с молоком факто­ров неспецифического иммунитета очень значима

17. Содержание панкреатической рибонук­леазы и ангиогенина в молочном сырье. Уро­вень ангиогенина в коровьем молоке зависит от генетических, физиологических, техниче­ских факторов. Он может колебаться в преде­лах 1-8 мг/л.В свежевыдоенном молоке кор. 2-5 мг/л.,в мол. На ГМЗ не превышает 1,5 мг/л. В кор.мол. панкреат. Рибон. Содер­жится 12-32 мг/л Ангеогенин, мг/л: Подсыр. Сыв. 0 9-12; Творож. Сыво 0,5-0,8;. пахта от сбивания 0,6-0,9; Пахта от преобраз 0,09-0,13; Ультрафильтрат ц.м. и об. ; Ультрафильт­рат подсыр.сыв 0,18-0,27

18. Методы определения ангиогенина в молоч­ном сырье.Ранее для опред Анг. исполь­зовали св-во индуцировать рост крове­носных сосудов в животных тканях. Они были трудоемки, треб.спец. навыков хирур­гии,недостаточно специф, длит период от им­плантации жив.таблетки, с Анг. до проявле­ния реакции шло неск. суток. Для быстрого анализа, исп. экспресс-методы: опред. Анг.на основе св-ва конкурировать с панкреатиче­ской РНКазой А за места связывания с плацен­тарным ингибитором РНКазы(критерий содержания анг. в пробе- конц. несвязанной с ингибитором рибонук­леазы, активность которой определяется относи­тельно практически негидролизируе­мых ангиогенином субстратов, например дрож­жевой РНК) недостаток: не прим. для анализа биол.жидк. с большим содержанием РНКазы А без предварительной от нее очи­стки. Ифа анг.исп. в 2 вариан­тах:1)неконкурент. Анализ: чувствительные колич.иммуноферментные методы, используя поликлональные антитела, которые специфич­ные к бычьему анг. и не связ. с пан­креатической рибонуклеазой., количествен­ный метод опред. бычьего ангиогенина в чис­тых растворах на основе ИФА: проведении конкурентного ИФА при использовании поли­клональных AT, коньюгированных с перок­сидазой хрена (ПХ). 2)конкурент.метод Анализа ИФА:наиб чувствит.и позвол. Опреде­лить пикограммовые кол-ва в-ва, .в основе лежит конкуенция за связ-ние с коньюга­том АТ-ПХ между анг. Сорбирован­ным и вносимым с лунки планшетов с анализи­руе­мым раствором.чувствит ИФА (при. 0,1 нг/мл-вестерн-блоттинг

19. Структура, физико-химические и биологиче­ские свойства иммуноглобулинов коровьего молока.

Иммуноглобулины - высокомолекулярные белки, имеющие общие физико-химические свойства и выполняющие функции антител.

Антитела в организме выполняют две основ­ные функции:распознавание и специфиче­ское связывание соответствующих антигенов,; эффекторная, заключающаяся в индукции важнейших физиологических процес­сов, направленных на уничтожение антигена: лизис чужеродных клеток через активацию системы комплемента, стимуля­ция специализированных иммунокомпетент­ных клеток, выделение фармакологически активных веществ и т. д.

Иммуноглобулины по своей химической структуре относятся К гликопротеидам, высоко­молекулярным соединениям, состоя­щим из последовательности L-аминокислот, соединенных между собой пептидными свя­зями. Кроме аминокислот в структуру иммуног­лобулинов включены олигосаха­риды.

По своим антигенным, эффекторным свойст­вам и структуре (молекулярная масса, состав и последовательность аминокислотных остатков) иммуноглобулины подразделяются на пять основных классов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE. В коровье молоке в норме содержание иммуноглобулинов 1,9-3,3 % от общего содер­жания белка. Однако в молозиве эта величина составляет 50-70 % что обусловлено весьма значительной ролью этих белков в механизмах пассивной защиты потомства в ранний период постнатального развития

Фрагмент молекулы IgG состоит из четырех ветвей: двух легких цепей, и двух тяжелых цепей, связанных между собой дисульфид­ными мостиками.

При действии протеолитического фермента папаина молекула IgG распадается на три фрагмента,

Молекулы иммуноглобулинов имеют много S—S-связей, которые можно разделить на 3 категории: межцепочечные связи, образуемые внутри структурной единицы между Н- и L-цепями и между Н- и Н-цепями; внутрицепочеч­ные S—S-связи, возникающие в пределах одной и той же легкой или тяже­лой цепи (обычно 2 в легкой и 4 в тяжелой цепи), и связи между Н-цепями отдельных четырехцепочечных комплексов.

При исследовании аминокислотной последова­тельности было обнаружено, что все легкие и тяжелые цепи имеют одну принци­пиальную структурную особенность: они состоят из двух частей -вариабельной (V) и константной (С).

IgG, обладает кислотными свойствами, a IgG₂ щелочными и его содержание по сравне­нию с IgG, незначительно.

Электрофоретическая подвижность IgG незна­чительна и составляет 2,04 см² –В^-1 с^-1. Белок очень чувствителен к воздействию высо­ких температур. Денатурирует и утрачи­вает активность при нагревании до 100 ⁰С, а также при высушивании. Только в последние семь лет, благодаря новым технологиям, стало возможным обрабатывать молозиво и сохранить большинство присутствующих в нём видов иммуноглобулинов.

20. Методы определения иммуноглобулинов.

1) радиальной иммунодиффузии; 2) иммуно­электрофорез и 3) иммунофлюоресценции.

Метод радиальной иммунодиффузии. за­ключается в оценке диаметра колец преципи­тации, возникающих при взаимодейст­вии в геле антигена и антитела. Стандартные антисыворотки с антителами смешивают с растопленным агаром. Эту смесь заливают на специальные пластины. После ее застывания на каждой пластине специ­альным пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм. В лунки микропипеткой вно­сят по 2 мкл последовательных разведе­ний (1:1, 1:2, .....1:8) стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов, а также такое же количество разведений иссле­дуемой сыворотки (с неизвестным содер­жанием иммуноглобулинов).

Пластины инкубируют при 4°С в тече­ние 24 ч и затем оценивают результаты. Анти­ген диффундирует в слое агара, содержа­щего антитела к человеческим иммуног­лобулинам, в результате чего вокруг лунок образуются кольца преципитации. Чем выше концентрация иммуноглобулинов, тем больше диаметр кольца. Вначале оценивают размеры колец преципитации вокруг лунок, в которые были внесены стандартные сыво­ротки различного разведения с известной кон­центрацией иммуноглобулинов. По этим результатам строят кривую, отражающую зависимость между диаметром (площадью) кольца преципитации и концентрацией имму­ноглобулина. Такую кривую строят для каж­дой пластины. Затем измеряют диаметр колец преципитации в испытуемом препарате и по стандартной калибровочной кривой опреде­ляют искомую концентрацию иммуноглобули­нов.

Метод иммуноэлектрофореза представ­ляет собой сочетание электрофоретического разделения белков сыворотки и последующей радиальной иммунодиффузии с образованием преципитатов.

Для проведения реакции расплавленный агар наносят на предметное стекло и делают в нем лунку. В лунку вносят исследуемую сыво­ротку и пластину помещают в электрическое поле, под действием которого происходит разделение различных белков сыворотки. По окончании электрофореза в агаровой пла­стине вырезают траншею, в которую вносят стандартную антисыворотку, содержащую антитела к определенным антигенам. Если в исследуемой сыворотке имеются искомые антигены (парапротеин), уже через несколько суток в агаровом слое образуются полосы преципитации.

Радиоиммунный метод наиболее информа­тивным, основан на исследовании характера взаимодействия антитела с антигеном с образо­ванием иммунного комплекса, в один из компонентов которого (антиген или анти­тело) введена радиоактивная метка. С этой целью в исследуемую жидкость, в которой предполагается наличие антигена, добавляют известное количество такого же меченного антигена и стандартное количество антисыво­ротки с соответствующими антителами. Если в исследуемой жидкости отсутствует иско­мый специфический антиген, то около 70–80% меченого антигена связывается с антителами, обусловливая высокую радиоактивность обра­зующегося преципитата. Если же в биоло­гической среде присутствует искомый антиген, он конкурирует с меченным антиге­ном и связывает часть антител. В результате радиоактивность преципитата падает по сравне­нию с контролем. Вначале на стенках полистероновых пробирок сорбируют анти­тела против определенного антигена. В эту же пробирку вносят исследуемую сыворотку. Если там содержатся искомые антигены, они взаимодействуют с антителами и вместе с ними фиксируются на стенках пробирки. За­тем в пробирку вводят антитела к данному антигену, меченные ферментом, которые также присоединяются к образовавшемуся иммунному комплексу и остаются на стенках пробирки. Для обнаружения и количествен­ной оценки этих комплексов в пробирку добав­ляют Н₂О₂ и хромогены. Фиксирован­ный к стенке пробирки фермент (разлагает Н₂О₂ с выделением кислорода, к-ый окисляет хромоген-желтый цвет. Интенсивность окраши­вания и, количество искомого анти­гена оценивают фотометрически.