Прямой мфа (предложен Кунсом и Капланом, 1942, 1950 гг.).
Непрямые мфа:
а) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Уэллера и Кунса, 1954 г.);
б) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки или иммуноглобулина (метод Гольдвассера-Шепарда, 1858 г.).
Прямой МФА. Этот метод технически наиболее прост и более специфичен по результативности и поэтому более широко применяется в практической работе.
Сущность и техника прямого МФА заключается в том, что на предметное стекло с фиксированным на нем мазком, или мазком-отпечатком из вируссодержащего материала наносят 2-3 капли специфической подозреваемому антигену (вирусу) флуоресцирующей иммунной сыворотки, или иммуноглобулина и помещают в чашку Петри с комочком ваты, смоченным водой( влажная камера) и выдерживают в термостате в течение 30-40 минут при 36-37° С, а затем промывают, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой в люминесцентном микроскопе.
Если антиген и антитела специфичны, образуется комплекс «антиген + антитело», который не смывается при промывании мазка, и при микроскопии препарата будет отчетливо видно яркое салатно-зеленое свечение антигена за счет адсорбированных на нем флуоресцирующих антител.
Если же антитела были неспецифичны антигену, находящемуся в мазке, или антигена в мазке вообще не было (от здоровых животных), то свечения антигена не будет, и поле зрения будет темным, потому что антитела не связались с фиксированным мазком и смылись при промывании мазка. Предметные стекла для МФА должны быть тонкие, чистые и хорошо обезжиренные.
К недостаткам прямого метода следует отнести то, что при этом методе в лаборатории на каждое вирусное заболевание нужно иметь специфическую флуоресцирующую сыворотку или глобулины, а они пока еще сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.
Рисунок:
Непрямые МФА называются так потому, что флуоресцирующие антитела адсорбируются не на сам вирусный антиген, а на посредника, в качестве которого может быть специфическое вирусному антигену неокрашенное антитело (при антивидовом методе) или комплемент (при антикомплементарном методе).
Непрямой МФА с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки. На фиксированный мазок или отпечаток наносят специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) иммунную неокрашенную сыворотку или иммуноглобулин, и выдерживают во влажной камере или термостате при 37°С 30-40 минут, затем промывают буферным раствором и водой. Если в мазке имеется антиген, специфичный антителам сыворотки, образуется комплекс «антиген + антитело» (Аг + Ат), который не смывается при промывании мазка, но и не светится(!) в люминесцентном микроскопе. Поэтому мазок дополнительно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулином (антивидовую сыворотку или глобулин получают путем гипериммунизации кроликов или других видов животных сывороткой или глобулинами того вида животньх, на которых получали специфическую для вируса гипериммунную нефлуоресцирующую сыворотку, и такую антивидовую сыворотку обрабатывают флуорохромом, обычно ФИТЦ). Антивидовую флуоресцирующую сыворотку наносят на мазок и выдерживают его во влажной камере при 37° С 30-40 минут, затем промывают водой или буфером и водой, высушивают на воздухе и просматривают мазок. Антитела из флуоресцирующей антивидовой сыворотки, если они специфичны глобулинам неокрашенной иммунной противовирусной сыворотки, адсорбируются на комплексе Аг + Ат; образуется новый комплекс: «Аг (вируса) + At противовирусной неокрашенной сыворотки (они же являются Аг для антивидовой сыворотки) + Ат (флуоресцирующие) антивидовой сыворотки».
При просмотре под люминесцентным микроскопом образовавшийся комплекс будет светиться ярким салатно-зеленым цветом за счет флуоресцирующих антител антивидовой сыворотки.
Если же на первом этапе обработки компоненты были неспецифичны или не было в мазке антигена, комплекс «Аг+Ат» не образуется и антивидовые флуоресцирующие антитела не свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.
Рисунок:
Непрямой МфА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки. Этот метод по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставят реакция на предметном стекле и вместо гемолитической системы используют флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку.
Получают антикомплементарную сыворотку путем гипериммунизации кроликов нативной свежей сывороткой морской свинки (комплемент). У кролика образуются антикомплементарные антитела, которые будут специфичны белкам сыворотки крови морской свинки (комплементу). В реакцию они будут вступать только с сывороткой крови морской свинки, которая является комплементом в РСК. Такую антикомплементарную сыворотку обрабатывают флуорохромом ФИТЦ. Получается флуоресцирующая антикомплементарная сыворотка.
На приготовленный и фиксированный мазок вначале наносят одновременно специфическую предполагаемому в мазке антигену (вирусу) нефлуоресцирующую иммунную сыворотку и комплемент в рабочих титрах, контактируют в термостате при 37° С во влажной камере 30-40 минут, а затем промывают водой.В случае, если антиген в мазке будет специфичен нанесенным антителам, образуется комплекс «Аг вируса + Ат», на который адсорбируется комплемент и весь этот комплекс «Аг вируса + Ат иммунной неокрашенной сыворотки + комплемент» не смоется, но свечения под люминесцентным микроскопом не будет. Чтобы обнаружить этот комплекс, на мазок дополнительно затем наносят антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и вновь контактируют во влажной камере термостата 30-40 минут, после чего промывают, высушивают на воздухе и смотрят под люминесцентным микроскопом.
Флуоресцирующие антитела из антикомплементарной сыворотки адсорбируются на комплексе и весь вновь образовавшийся комплекс «Аг вируса + Ат специфической неокрашенной противовирусной сыворотки + комплемент + антикомплементарное Ат» в результате будет ярко светиться салатно-зеленым цветом.
Преимуществом данного метода является то, что при этом методе для диагностики на любое бактериальное или вирусное заболевание достаточно иметь в лаборатории лишь одну антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку и наборы специфических гипериммунных неокрашенных сывороток.