Вирусология. Тема 3 Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия в вирусологии
В люминесцентной микроскопии, используется явление фотолюминесценции т.е. способность объекта светиться при пропускании через него пучка ультрафиолетовых лучей.
Источниками ультрафиолетовых лучей в люминесцентном микроскопе являются ртутно-кварцевые лампы. Для проведения люминесцентной микроскопии в настоящее время выпускаются люминесцентные микроскопы серии ЛЮМАМ, которые должны быть установлены в специальном затемненном помещении. При люминесцентном исследовании перед микроскопией на мазки наносят специальное нефлуоресцирующее масло.
Некоторые
объекты, рассматриваемые при люминесцентной
микроскопии, могут
давать собственную люминесценцию
(аутолюминесценцию), как,
например, грибки-возбудители микроспории;
такие объекты смотрят без всякой
дополнительной окраски. Однако бактерии
и вирусы аутолюминесценцией не обладают,
поэтому
мазки надо обрабатывать либо специальными
красками
(флуорохромы),
либо мечеными (флуоресцирующими)
антителами.
В
связи с этим все методы обработки мазков
для люминесцентной микроскопии
можно разделить на две группы;
Метод флуорохромирования (МФ). 2. Методы флуоресцирующих антител (МФА)
Метод флуорохромирования (мф)
По своей технике этот метод почти ничем не отличается от методов обычной окраски мазков, применяемых при световой, обычной микроскопии. Для этих целей используют анилиновые красители, но краски берут такие, которые обладают явлением фотолюминесценции, т.е. светятся в момент облучения их ультрафиолетовыми лучами. Такие краски называются флуорохромами, а окраска ими - методом флуорохромирования. К флуорохромам относят такие красители, как аурамин, корифосфин, родамин, трипафлавин, риванол, флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) и другие. Разведения для большинства красителей обычно готовят 1:1000, 1:10000.
Для исследований можно готовить мазки из патматериала, мазки-отпечатки, гистосрезы, зараженные культуры ткани, выращенные на покровных стеклах.
В мазках-отпечатках при вирусных инфекциях наблюдают свечение в ядрах или цитоплазме пораженных вирусом клеток в виде различных гранул и телец-включений, а если клетка поражена вся и антиген содержится как в ядре, так и в цитоплазме, может светиться вся клетка. Непораженные вирусом клетки обычно не светятся и создают темный фон.
Метод флуорохромирования широко применяется при диагностике бактериальных болезней, и вирусных – на наличие в исследуемом материале телец-включений.
Методы флуоресцирующих антител (МФА)
МФА основаны на принципе специфического взаимодействия антигена со специфическими антителами.
Антигены – это генетически чужеродные макроорганизму вещества белковой природы, которые при попадении или введении в организм (парэнтерально) обладают способностью вызывать образование специфических антител. В вирусологии антигенами являются возбудители – вирусы и их белки.
Антитела – это специфические белки сыворотки крови макроорганизма (гамма-глобулины), образующиеся в ответ на попадение или введение в организм антигенов и дл борьбы с ними.
Антигены и антитела специфичны друг другу, взаимодействуют друг с другом и in vivo и in vitro. Реакции взаимодействия антигенов и антител можно использовать в диагностических целях. Если мы имеем специально полученные диагностические сыворотки животных-доноров с заведомо известными антителами, то, поставив серологическую реакцию, можно выявить неизвестный, специфичный этим антителам антиген – вирус. И наоборот: если у нас имеется заведомо известный антиген-диагностикум (идентифицированный, убитый или ослабленный вирус), то, поставив с его помощью серологическую реакцию, мы м можем обнаружить специфические этому антигену антитела в сыворотке крови больного животного и, следовательно, диагностировать болезнь.
При постановке МФА используют антитела меченые, т.е. предварительно окрашенные флуорохромом, и поэтому такие антитела под ультрафиолетовыми лучами светятся (флуоресцирующие антитела). Наиболее часто для окрашивания антител применяют ФИТЦ, эта краска дает антителам салатно-зеленое свечение. Поэтому, если в мазке есть антиген, специфический данным антителам, то антитела, оседая и связываясь с данным антигеном, будут обеспечивать образовавшемуся комплексу свечение салатно-зеленым цветом. Следовательно, здесь свечение антигена происходит не за счет окрашивания его, а за счёт связавшихся с антигеном специфических окрашенных антител. Таким образом, все МФА являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставят их не в пробирках, а на предметном стекле. В настоящее время налажено производство флуоресцирующих иммунных сывороток и гамма- глобулинов централизованным путем. Выпускаются они в сухом виде в ампулах с приложением на каждую упаковку инструкции по применению с указанием титра антител. Их растворяют для использования по мере надобности согласно инструкции, хранят в холодильниках при +4° С. Некоторые флуоресцирующие сыворотки выпускают в жидком виде.
МФА находят широкое применение при диагностике многих вирусных болезней, таких как бешенство, грипп, болезнь Ауески, вирусный гепатит плотоядных, чума, оспа, ИРТ, ИЛТ и многие др.
Все методы флуоресцирующих антител можно разделить на 2 разновидности: