1.5. Жидкостная хроматография

В жидкостной хроматографии подвижной фазой является жидкость. Подвижная (жидкая) фаза сама часто способна сорбироваться в неподвижной фазе, играя в ряде случаев роль вытеснителя, или способна в той или иной степени вступать во взаимодействия с молекулами сорбатов. В силу этого сорбционная среда и сорбционные равновесия в жидкостной хроматографии существенно сложнее, чем в случае газовой хроматографии. Жидкостная хроматография может быть использована для разделения нелетучих веществ с молекулярной массой от 300 до нескольких миллионов, включая предельно сложные макромолекулы полимеров, белков, нуклеиновых кислот.

1.6. Тонкослойная хроматография

В методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) неподвижная твердая фаза тонким слоем наносится на пластинку из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу и другие вещества с высокой адсорбционной способностью. Выбор растворителя зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов.

При нанесении сорбента в виде водного раствора при комнатной температуре частицы сорбента остаются покрытыми тонкой пленкой воды. Разделяемые вещества затем распределяются между подвижным растворителем и фиксированной неподвижной водной фазой согласно их растворимости. При этом ТСХ является разновидностью распределительной хроматографии.

После сушки сорбента нагреванием тонкая пленка воды исчезает и разделяемые вещества распределяются между подвижным растворителем и твердым неподвижным сорбентом согласно их адсорбционной способности. При этом ТСХ является разновидностью молекулярно-адсорбционной хроматографии.

Пробу анализируемой жидкости в виде пятна или полосы наносят на стартовую линию в 2-3 см от края пластинки. Нанесение пробы осуществляют микропипетками, микрошприцами или специальными приспособлениями. Край пластинки погружают в растворитель (или систему растворителей), который действует как подвижная фаза. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их разделению. Стандартное вещество ("свидетель") в том же растворителе, что и анализируемая проба, наносится на стартовую линию (рис. 2) и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым.

Для полученных пятен (зон) веществ на хроматограмме рассчитывают индекс удерживания R по формуле (4). Учитывая, что время перемещения всех веществ и растворителя одинаково, формула (4) приобретает следующий вид:

R = L вещества / L растворителя, (3)

г де L вещества - это путь, пройденный веществом, L растворителя - это путь, пройденный растворителем.

Совпадение индекса удерживания R компонента смеси и одного из "свидетелей" дает основание для отождествления вещества с учетом возможных наложений. Несовпадение R интерпретируется более однозначно: оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего вещества (рис.2).

По окончании хроматографирования хроматограмму высушивают и проявляют химическим или физическим способом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентами смеси. При обработке, например, парами йода четко проявляются органические соединения. В физических способах проявления используется способность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения. Вещества, обладающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фотоматериалов.

Количественные определения в ТСХ могут быть сделаны или непосредственно на пластинке, или после удаления вещества с пластинки. При непосредственном определении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуированному графику находят количество вещества. Применяют также прямое спектрофотометрирование пластинки с помощью спектроденситометров. Наиболее точным считается метод, в котором вещество после разделения удаляется с пластинки и анализируется спектрофотометрическим или иным методом.