Оборудование рабочего места На рабочем столе должно быть все необходимое для работы:

• микроскоп

• иммерсионное масло

• бактериологические петли

• спиртовка

• набор красок

• промывалка и ванна для промывки препаратов

• предметные стекла и салфетки для их промывания

• штатив для пробирок с культурами

• пинцет для извлечения стекол

• фильтровальная бумага для высушивания препаратов

• банка для отработанных стекол

На рабочем месте допускается иметь только рабочую тетрадь, в которой делаются записи и зарисовки.

Категорически запрещается:

1. Работать в учебных лабораториях без халатов и шапочек, выпускать из-под спецодежды волосы, воротнички.

2. Входить в учебные лаборатории в головных уборах и верхней одежде.

3. Курить и принимать пищу в учебных лабораториях кафедры.

4. Класть на столы портфели и сумки.

5. Зажигать спиртовки от спиртовок. В случае воспламенения спирта огонь тушить асбестовой тканью, полотенцем.

6. Выносить из лаборатории микробные культуры.

Перед началом работы студенты обязаны:

1. Надеть медицинский халат, аккуратно застегнув его на все пуговицы.

2. Портфели, книги и другие личные вещи положить в шкаф.

3. Проверить состояние рабочего стола и микроскопа. О всех обнаруженных недочетах немедленно сообщить дежурному студенту и преподавателю.

В о время работы необходимо:

1. Содержать рабочее место в образцовом порядке и чистоте.

2. Бережно обращаться с микроскопом, посудой, инструментами и другими предметами лабораторного оборудования.

3. Проявлять максимальное внимание ко всем этапам работы с культурами и животными, зараженными патогенными микробами.

4. Во время посевов не разговаривать и не ходить по лаборатории.

5. На всех пробирках и чашках с посевами написать название, дату.

6. В случае загрязнения заразным материалом поверхности стола и других предметов, кожи рук и лица – обработать дезинфицирующим раствором и немедленно сообщить о случившемся преподавателю.

7. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели, ватные тампоны помещать в сосуд с дезинфицирующим раствором. Пинцеты, бактериологические петли, иглы после работы с исследуемым материалом прожигать в пламени горелки.

По окончании работы необходимо:

1. Привести в порядок рабочее место.

2. Все использованные предметные стекла положить в банку с дезинфицирующим раствором.

3. Все засеянные пробирки и чашки сдать по счету дежурному студенту для помеще­ния в термостат.

4. Отработанный материал (культуры, микробный материал, трупы зараженных жи­вотных) сдать дежурному лаборанту для стерилизации.

5. Привести в порядок микроскоп.

6. Обработать руки дезинфицирующим раствором и тщательно вымыть их с мылом.

7. Дежурному вменяется в обязанность:

• пробирки и чашки, засеянные учебной группой, зарегистрировать в "Журнале учета культур" и сдать лаборанту;

• весь отработанный материал зарегистрировать в "Журнале учета культур" и сдать лаборанту;

• проверить состояние рабочих столов и устранить дефекты уборки;

• выключить свет;

• проветрить помещение.

8. Порядок хранения, обращения и отпуска патогенных микробов осуществляется преподавателями и учебно-вспомогательным персоналом кафедры в соответствии со специальной инструкцией Министерства здравоохранения.

Методы обеззараживания отработанного материала и контаминированных патоген­ными микробами объектов внешней среды

Перед сбрасыванием патологического материала в канализационную сеть его подвер­гают дезинфекции.

Использованные в работе предметные стекла, пипетки, стеклянные шпателя и метал­лические инструменты сразу же после работы опускают в стеклянные банки с дезинфици­рующим раствором, которые должны находиться на рабочем столе. Посуда, в которой выращивались микроорганизмы (чашки, пробирки, флаконы), склады­ваются в биксы или металлические бачки для обеззараживания путем кипячения или автоклавирования.

Рабочее место по окончании работы подлежит уборке с применением дезинфици­рующих средств. Используют более концентрированные растворы, чем для обработки.

Пинцетом берут кусочек ваты, смоченной дез. раствором, и протирают поверхность стола на рабочем месте. Если разбилась пробирка с культурой, пролилась жидкость с заразным материалом или материал попал на одежду, обработку проводят немедленно, заливая это место дез. раствором или помещают ватный тампон, смоченный дез. раство­ром. О случившемся сообщают преподавателю или заведующему лабораторией.

М етоды антисептической обработки рук лабораторных работников, контаминированных исследуемым материалом, культурами патогенных микробов

По окончании работы руки обрабатывают дезинфицирующим раствором. Использу­ют ватные тампоны или марлевые салфетки, смоченные в 70° спирте этиловом.

Последовательность обработки: тыл кисти, ладонная поверхность, межпальцевые пространства и ногтевые ложа, т. е. с учетом первоначальной обработки менее, а потом наиболее загрязненных мест. Вначале обрабатывают левую, а потом правую кисть руки.

При загрязнении рук культурой патогенного микроба или патологическим материа­лом сразу же обрабатывают данный участок кожи, покрывая его на 3-5 мин. ватой, смо­ченной в дез. р-ре. После обработки рук дез. раствором их моют теплой водой с мылом.

М икроорганизмы по степени опасности заражения работающих с ними лиц подраз­деляют на 4 групп

I. Возбудитель чумы.

П. Возбудители холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, сапа, Ку-

лихорадки, бластомикоза, кокцидиоидоза, гистоплазмоза, ВИЧ, гепатитов В, С, Д, клещевого энцефалита.

Ш. Возбудители коклюша, возвратного тифа, столбняка, ботулизма, дифтерии, лепры, брюшного тифа, дизентерии, некоторых микозов, гриппа, полиомиелита, гепатитов А, Е.

IV. Возбудители пневмонии, пищевых токсикоинфекций, газовой гангрены, септице­мии, кандидозов; микробы - показатели санитарного состояния объектов окружаю­щей среды.

Работу с культурами возбудителей 1 и 2 групп можно проводить только в специальных лабораториях строгого режима с разрешения органов здравоохранения России.

Работа с особо опасными микроорганизмами регламентируется специальной инструкцией и проводится в режимной лаборатории

Работа с возбудителями З и 4 групп проводится в соответствии с правилами устройства, техники безопасности, производственной санитарии в лабораториях СЭС и других бактериологи­ческих лабораториях.

Типы микроскопов и принципы микроскопии

Обычная световая микроскопия

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

Механическая часть включает штатив (который состоит из основания тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус, револьвер для крепления объективов, предметный столик для крепления препарата, кронштейн с винтом для крепления и перемещения конденсора, а также механизм для грубой (макроскопический винт) и тонкой (микроскопический винт) настройки изображения путем вертикального передвижения тубуса или предметного столика.

Оптическая часть микроскопа представлена осветительной системой, объективами и окулярами. Осветительная система состоит из конденсора с диафрагмой, зеркала, а также отдельного или встроенного осветителя.

Зеркало служит для отражения световых лучей по направлению к объективу. Одна сторона одна сторона зеркала плоская другая – вогнутая. При работе с искусственным источником освещения и конденсором используют вогнутую сторону зеркала.

Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания лучей, идущих от источника света, в одной точке – фокусе. Фокус должен находиться в плоскости рассматриваемого объекта. При микрокопировании с дневным светом конденсор должен быть поднят до уровня предметного столика. При изучении неокрашенных объектов следует опускать конденсор.

Диафрагма находится под конденсором и регулирует объем лучей, проходящих сквозь препарат. Окрашенные препараты рассматривают при открытой диафрагме. При исследовании неокрашенных препаратов отверстие диафрагмы суживают.

Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя (фронтальная) линза производит увеличение. Лежащие за ней линзы (коррекционные) устраняют недостатки оптического изображения.

На оптике объективов указывают их увеличение: Х8, Х10, Х40, Х90, Х100.

Все объективы подразделяют на сухие и иммерсионные (погруженные). При сухом объективе между фронтальной линзой и препаратом при рассмотрении находится воздух. Ввиду разницы показателей преломления стекла (на котором помещается препарат) и воздуха часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя.

В иммерсионных объективах между фронтальной линзой и препаратом помещают жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как и стекла, или близкий к нему. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем достигается наилучшее освещение.

В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, для объективов масляной иммерсии – кедровое, терпеновое или синтетическое иммерсионное масло. Для объективов, используемых при работе в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин.

Окуляры имеют две линзы: верхняя называется главной, нижняя – собирательной. Окуляры обозначают по тому увеличению, которое они дают: Х5, Х7, Х10, Х12, Х15. По количеству окуляров микроскопы бывают монокулярные – имеющие один окуляр, и бинокулярные – имеющие два одинаковых окуляра.

Общее (полезное) увеличение микроскопа равняется произведению увеличения объектива и увеличения окуляра. Однако увеличение не обеспечивает качество изображения. Четкость изображения определяется разрешающей способностью микроскопа, т.е. возможностью различать две близко расположенные точки как отдельные. Предел разрешения – минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно – зависит от длины луча, которым освещается объект. Предельная разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм.

Правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы:

1. Настроить освещение микроскопа, используя вогнутое зеркало и объектив.

2. На приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами.

3. Повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива 90 х.

4. Осторожно погрузить объектив в каплю масла под углом бокового зрения.

5. Установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта.

6. Провести окончательную фокусировку препарата микрометрическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь поломку покровного стекла или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1мм).

7. По окончании работы микроскопа необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом микроскопе. Фазово-контрастная микроскопия основана на явлении интерференции света, прошедшего и не прошедшего через объект, и позволяет наблюдать прозрачные объекты, отличающие­ся от окружающей среды (или других структур клетки) по показателю преломления или по толщине и вызывающие изменение фазы прошедшего через них света. Благодаря специ­альному приспособлению в объективе (фазовая пластинка) и в конденсоре (кольцевая диафрагма) эти объекты выглядят более темными (позитивный фазовый контраст) или более светлыми (негативный фазовый контраст) по сравнению с окружающей средой.

Темнопольная микроскопия (ультрамикроскопия) основана на явлении светорас­сеивания. При темнопольной микроскопии в объектив попадают только лучи, рассеянные объектом, и не попадают прямые лучи от осветителя. Поэтому наблюдаемые микроорга­низмы кажутся ярко светящимися на темном фоне.

Темнопольную микроскопию применяют для прижизненного изучения лептоспир, спиро­хет, а также микроорганизмов слишком мелких, чтобы их можно было различить при обычном светлопольном освещении. Для темнопольной микроскопии используют обыч­ные объективы и специальные темнопольные конденсоры.

Люминесцентная микроскопия основана на использовании явления флюоресцен­ции. Применяют специальные люминесцентные микроскопы или приспособления к обыч­ным микроскопам. Так как большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, то их предварительно окрашивают (флюорохромируют) сильно разве­денными растворами специальных красителей (флюорохромы), которые связываются с определенными структурами клетки.

Люминесцентную микроскопию применяют также для выявления антигенов и антител. С этой целью используют метод иммунофлюоресценции (люминесцентно-серологический метод). Этот метод позволяет выявить в препарате микробы, содержащие определенные антигены. Для их обнаружения необходимо иметь антисыворотки, содержащие антитела к этим антигенам (к антисывороткам химическим путем присоединены молекулы флюоро-хромов - люминесцирующие сыворотки).

На фиксированный препарат во влажной камере наносят люминесцирующую сыворотку, инкубируют, промывают раствором хлорида натрия, высушивают и рассматривают в люминесцентном микроскопе. Если в препарате есть микробы, содержащие антиген, антитела к которому были в люминесцирующей сыворотке, они ярко светятся. Остальные микробы не люминесцируют.

Разрешающая способность световой микроскопии, фазово-контрастной, люминесцентной определяется длиной волны света, что препятствует изучению объектов размером менее 0,2 мкм

Электронная микроскопия. Изображение в электронном микроскопе образуется не с помощью световых лучей и стеклянных линз, а с помощью потока электронов, который фокусируется электрическим или магнитным полем. Разрешающая способность примерно в 2000 раз больше, чем светового (0,2 мкм), и с его помощью можно увидеть даже крупные молеку­лы. Применение электронного микроскопа значительно расширило знания о вирусах, фагах и других микроорганизмах.