Л/р4. Определение содержания гемоглобина в крови.

Цель.

Ознакомиться с устройством гемометра Сали и ФЭК. Освоить методы гемоглобинометрии, оценить различия, полученные разными методами.

Приборы и материалы.

1. Пластиковые пеналы для обездвиживания крыс, скарификаторы, ножницы, вата, спирт этиловый 96%, диствода, йод, моток ниток, фильтровальная бумага.

2. Гемометры Сали (ГС-2 или ГС-3) с капиллярными пипетками для забора 20 мкл крови, резиновые трубочки, 0,1 н раствор соляной кислоты, диствода. Объект исследования: белая лабораторная крыса или человек.

Ход работы.

Определение количества гемоглобина в крови проводят колориметрическими методами. Один из них (гематиновый метод Сали) основывается на колориметрии солянокислого гематина, который образуется при смешивании крови с соляной кислотой. При этом красноватый цвет жидкости становится бурым. Гемометр Сали состоит из двух запаянных пробирок со стандартной цветной жидкостью 1% раствор солянокислого гематина в глицерине), содержащей 16,67 г% гемоглобина (16,67 г на 100 мл крови). Между ними расположена градуированная пробирка, имеющая две шкалы. Одна – с делениями от 0 до 23 служит для определения гемоглобина в граммах на 100 мл крови, т. е. в грамм процентах; другая шкала с делениями от 0 до 140 показывает единицы гемоглобина (процент гемоглобина).

В градуированную пробирку, находящуюся в среднем прорезе, глазной пипеткой наливают 0,1н раствор соляной кислоты. 0,02 мл крови набирают в капилляр от гемометра Сали, обтирают кончик капилляра ватой или фильтровальной бумагой и осторожно выдувают кровь на дно пробирки так, чтобы верхний слой соляной кислоты остался неокрашенным. Не вынимая капилляра, промывают его раствором соляной кислоты из верхнего прозрачного слоя (несколько раз насасывая и выпуская раствор обратно). Перемешивают содержимое пробирки, постукивая пальцем по дну, и оставляют ее стоять до полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин (на 5-10 минут). Ударяя пальцем по нижней части пробирки, тщательно размешивают кровь и оставляют ее на 5 мин. для образования солянокислого гематина. По истечении этого времени приливают в пробирку по каплям дистиллированную воду, размешивая стеклянной палочкой до тех пор, пока цвет раствора исследуемой крови полностью сравняется с цветом стандартной жидкости. Отмечают, на каком делении находится в градуированной пробирке нижний мениск раствора крови, показывающий содержание гемоглобина в г% или единицах (процентах).

2. Содержание гемоглобина в эритроцитах (СГЭ) определяется по цветовому показателю, или фарб-индексу Fi (от farb – цвет, index – показатель) – относительной величине, характеризующей среднее содержание гемоглобина в одном эритроците.

где Х_Hb — найденное количество гемоглобина, N_Hb — нормальное количество гемоглобина, X_эр — найденное количество эритроцитов, N_эр — нормальное количество эритроцитов.

Если принять, что в норме в 1 л крови содержится 167 г гемоглобина и 5×10¹² эритроцитов, то подставляя эти значения в формулу, получим:

Е сли учесть, что Х_эр обычно выражается числом миллионов клеток, умноженным на 10¹², то цветовой показатель по упрощенной методике можно определить как:

цветовой показатель = 3 × Hb(г/л) / три первые цифры числа эритроцитов (в млн.).

3. Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (КГЭ, МСНС, Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) отражает степень насыщения эритроцитов гемоглобином в процентах. Его вычисляют путем деления концентрации гемоглобина (в граммах на 1 дл) на показатель гематокрита (в процентах):

MCHC = Hb (г / дл) / Ht (%) × 100%.

4. Средний объем эритроцита (ОЭ, MCV, Mean Сorpusculare Volume) вычисляют путем деления гематокрита (в мкм³) на общее число эритроцитов в 1 мкл:

MCV = Ht (мкм³) / RBC ( 10⁶ / мкл).

Этот показатель выражают в кубических микрометрах (мкм³), или в фемтолитрах (фл) Сследует учитывать, что для гематокрита 1% = 0,1 мкл, а 1 мкл = 10⁹ мкм³.

Практически для вычисления среднего объема эритроцита необходимо значение гематокрита в % увеличить в 10 раз и разделить на число миллионов эритроцитов в 1 мкл.

Рекомендации к оформлению.

Коротко запишите название л/р, ее цель и ход работы. Приводят рассчеты СГЭ, КГЭ, ОЭ. В выводах следует сравнить полученные показатели с нормой, оговаривая надежность метода Сали. Раскрыть связь между различными показателями, определенными в процессе данной работы.

1 . Содержание гемоглобина в грамм-процентах у мужчин колеблется от 13,3 до 18 г%, у женщин – от 11,7 до 15,8 г% (в среднем 13,7); в единицах (процентах) у мужчин – от 80 до 108 ед., у женщин – от 70 до 95 ед. У беременных гемоглобин может понижаться до 110 г/л. У детей первого года жизни наблюдается физиологическое снижение концентрации гемоглобина. У жителей северных регионов и высокогорных районов уровень Hb нередко оказывается выше приведенных значений на 10 г/л. Наконец, у пожилых людей (старше 65 лет) нижняя граница нормальных значений этого показателя достигает 122 г/л у мужчин и 110 г/л у женщин. При оценке уровня гемоглобина следует помнить, что суточные вариации содержания гемоглобина в периферической крови достигают 15% с максимумом по утрам. У крыс содержание гемоглобина составляет 148 г/л. Снижение содержания гемоглобина (анемия) может быть следствием кровотечений или повышенного гемолиза эритроцитов. Причиной анемии может быть недостаточность железа, B12, фолиевой кислоты. Анемия может возникнуть и вторично при разного рода хронических негематологических заболеваниях. Повышение уровня гемоглобина в крови наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся увеличением количества эритроцитов (эритроцитозы, первичные и вторичные).

2. В норме Fi = 0,75-1,0 = 0,86–1,05и очень редко = 1,1. В этом случае эритроциты называются нормохромными. Если Fi < 0,7, то такие эритроциты называются гипохромными. При Fi > 1,1 эритроциты именуются гиперхромными. Гипохромия встречается чаще всего, характерна для многочисленных железодефицитных анемий, талассемии, свинцового отравления и некоторых наследственных гемолитических анемий. Клетки выглядят бледными, в центре окраска отсутствует. Чаще всего гипохромия эритроцитов сочетается с микроцитозом.

Гиперхромия эритроцитов обусловлена повышением насыщения эритроцитов гемоглобином, характерна для состояний, сопровождающихся дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты (анемия Аддисона-Бирмера, дифиллоботриоз, хронические заболевания желудка и кишечника, алкоголизм, беременность). Нередко сочетается с макроцитозом и мегалоцитозом. В этом случае объем эритроцита значительно увеличивается, что позволяет ему содержать большую концентрацию гемоглобина. В результате создается ложное впечатление, будто эритроциты перенасыщены гемоглобином.

3. В норме МСНС колеблется в пределах 32-36%. Снижение МСНС ниже 30% характерно для абсолютной гипохромии эритроцитов (например, при железодефицитных анемиях, талассемии). Однако следует иметь в виду, что уменьшение МСНС может встречаться и при макроцитарных и особенно мегалоцитарных формах анемии. В этих случаях происходит непропорционально большее увеличение объема эритроцита по сравнению с увеличением его насыщения гемоглобином. Необходимо также помнить, что повышение MCHC больше 37% в клинике практически не встречается, так как это значение является верхним пределом растворимости гемоглобина в воде.

4. MCV < 80 фл встречается при микроцитарных анемиях (железодефицитных, сидеробластической, талассемии) и анемиях, которые могут сопровождаться микроцитозом (гемолитические анемии, гемоглобинопатии). MCV = 80-100 фл при нормоцитарных анемиях (острой постгеморрагической, апластической, гемолитических), а также для анемий, сопровождающихся на определенной стадии нормоцитозом (железодефицитные анемии в регенераторной фазе, миелодиспластические синдромы). MCV > 100 фл встречается при макроцитарных и мегалобластических анемиях, обусловленных дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, а также при различных патологических состояниях, нередко сопровождающихся макроцитозом (гемолитические анемии, болезни печени и т. д.).

Следует учитывать, что ошибка при определении содержания гемоглобина по Сали может достигать ± 30%, в связи с чем в настоящее время он не рекомендуется для характеристики гемоглобина. Основным методом определения концентрации гемоглобина является унифицированный цианметгемоглобиновый метод. Его принцип сводится к следующему: железосинеродистым калием (красной кровяной солью) гемоглобин окисляют в метгемоглобин, который с ацетонциангидрином образует окрашенный цианметгемоглобин. Через 20 минут концентрацию последнего определяют на фотоэлектроколориметре (ФЭК). Материалом исследования служит смесь 5,0 мл трансформирующего раствора, содержащего указанные реактивы (железосинеродистый калий и ацетонангидрид), с 0,02 мл крови. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе и затем рассчитывают концентрацию гемоглобина по калибровочному графику. Метод позволяет суммарно определить все разновидности гемоглобина, за исключением сульфгемоглобина.