Тема 2Физиология эритроцитов л/р3. Подсчет эритроцитов.

Цель.

Освоить метод фотоколориметрии. Определить количество эритроцитов, оценить различия, полученные при фотометрии и камерным методом.

Приборы и материалы.

1. Пластиковые пеналы для обездвиживания крыс, скарификаторы, ножницы, вата, спирт этиловый 96%, диствода, йод, моток ниток, фильтровальная бумага.

2. Микроскопы, счетные камеры, покровные стекла, смесители, мандрены, резиновые трубочки, 3%-ный раствор хлористого натрия, КФК-2, две кюветы с тощиной стенки 3 мм, пробирки, стаканчики. Объект исследования: белая лабораторная крыса или человек.

Ход работы.

1. Подсчет эритроцитов камерным методом обычно выполняют, следуя указаниям л/р 1. Его можно вести при малом увеличении. Камеру выбирают самостоятельно. Желательно сосчитать эритроциты во всех взятых по диагонали квадратах, начиная с левого верхнего. При этом учитываются те эритроциты, которые находятся внутри квадратика, на его верхней и левой стороне. Определить количество эритроцитов в 1 мкл цельной крови можно по формуле, приведенной в л/р 1.

2. Для фотоколориметрии разводят 0,02 мл крови (можно отмерять капилляром от гемометра Сали, см. л/р № 4) в 8 мл 3%-ного раствора хлористого натрия (разведение крови получается 1:400). После тщательного перемешивания, 60-минутной экспозиции и еще одного перемешивания, раствор с помощью глазной пипетки переносят в одну из кювет с оптическим слое м 3 мм, предварительно тщательно отмытых спиртово-эфирной смесью. Вторую кювету наполняют чистым растворителем. Следует обратить внимание, чтобы уровень жидкости не превышал отметки на боковой поверхности, иначе наблюдается переползание жидкости по углам, что создает впечатление протекания кюветы.

3. За 15 минут до начала измерний фотоколориметр заземляют и включают в сеть. Затем кюветное отделение закрывают и устанавливают красный светофильтр (2).

Во время прогревания кюветное отделение (1) должно быть открыто (при этом шторка перед фотприемниками перекрывает световой пучок).

При смене фильтра "Чувствительность" (3) должна находится в положение "1", а "Установка грубо" (4) – в крайнем левом положении (минимальная), чтобы предохранить регистрирующий прибор от перегрузки. Следует также помнить, что цвет шкалы "Чувствительность" (черный или красный) (3) должен соответствовать цвету шкалы светофильтра (2).

Псле смены светофильтра фотоприемник засвечивают пять минут. Проверяют установку стрелки на "0" по шкале коэффициентов пропускания Т при открытом кюветном отделении (1). При смещении стрелки от нулевого положения ее подводят к нулю с помощью потенциометра "Нуль", выведенного под шлиц.

4. Обе кюветы берут так, чтобы не касаться рабочих участков поверхности (ниже уровня жидкости), и стараясь не наклонять, помещают в кюветодержатель. Кювету с растворителем помещают в световой пучок. Закрывают крышку кюветного отделения, и с помощью ручек "Чувствительность" (3), "Установка грубо" (4) и "Точно" (5) устанавливают отсчет 100 по шкале колориметра. Таким образом, пролный световой поток условно принимается равным 100%.

Таблица 1. Кол-во эритроцитов (N, млн/мм³), соответствующее различным значениям оптической плотности (Д) при исследовании на ФЭК-М взвеси крови белых крыс (разведение 1:400; толщина слоя 3 мм) [Липецкая Т.С., 1989]

Д	N	Д	N	Д	N	Д	N	Д	N	Д	N	Д	N	Д	N
0,200	3,96	0,265	4,61	0,330	5,26	0,395	5,91	0,460	6,56	0,525	7,21	0,590	7,86	0,655	8,51
0,205	4,01	0,270	4,66	0,335	5,31	0,400	5,96	0,465	6,66	0,530	7,26	0,595	7,91	0,660	8,56
0,210	4,06	0,275	4,71	0,340	5,36	0,405	6,01	0,470	6,66	0,535	7,31	0,600	7,96	0,665	8,61
0,215	4,11	0,280	4,76	0,345	5,41	0,410	5,06	0,475	6,71	0,540	7,36	0,605	8,01	0,670	8,66
0,220	4,16	0,285	4,81	0,350	5,46	0,415	6,11	0,480	6,76	0,545	7,41	0,610	8,06	0,675	8,71
0,225	4,21	0,290	4,86	0,355	5,51	0,420	6,16	0,485	6,81	0,550	7,46	0,615	8,11	0,680	8,76
0,230	4,26	0,295	4,91	0,360	5,56	0,425	6,21	0,490	6,86	0,555	7,51	0,620	8,16	0,685	8,81
0,235	4,31	0,300	4,96	0,365	5,61	0,430	6,26	0,495	6,91	0,560	7,56	0,625	8,21	0,690	8,86
0,240	4,36	0,305	5,01	0,370	5,66	0,435	6,31	0,500	6,96	0,565	7,61	0,630	8,26
0,245	4,41	0,310	5,06	0,375	5,71	0,440	6,36	0,505	7,01	0,570	7,66	0,635	8,31
0,250	4,46	0,315	5,11	0,380	5,76	0,445	6,41	0,510	7,06	0,575	7,71	0,640	8,36
0,255	4,51	0,320	5,16	0,385	5,81	0,450	6,46	0,515	7,11	0,580	7,76	0,645	8,41
0,260	4,56	0,325	5,21	0,390	5,86	0,455	6,51	0,520	7,16	0,585	7,81	0,650	8,46

Затем поворотом ручки (6) кювету с растворителем заменяют на кювету с исследуемым раствором. Снимают отсчет по шкале колориметра, соответствующий коэффициенту пропускания Т в процентах и по шкале Д в единицах оптической плотности. Измерение повторяют 3-5 раз и окончательное значение определяют как среднее арифметическое. Кол-во эритроцитов, соответствующее найденной оптической плотности, находят по таблице 1.

Рекомендации к оформлению.

Коротко запишите название л/р, ее цель и ход работы. В выводах следует сравнить результаты двух приведенных методов между собой и с нормой. В 1 л крови белой крысы содержится в норме 7-8  10¹² эритроцитов, человека – 4,5-5,5  10¹². Наиболее частые причины эритропении и эритроцитоза указаны в л/р 2.