БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра микробиологии

Трансгенные животные. Иммуногистохимия.

Выполнил:

студент 5 курса 3 группы

Шульвинский Т. Э.

Преподаватель:

к. б. н. Нашкевич Н. Н.

Минск

2011

Оглавление:

1.1 Пути получения трансгенных животных 3

1.2 Трансгенные животные - продуценты антител. 6

2.1 Иммуногистохимия. 8

Список литературы 10

1. Пути получения трансгенных животных.

Первые трансгенные сельскохозяйственные животные были получены в 1985 г., хотя до настоящего времени не было разработано эффективного метода, который бы мог быть использован для создания генетически модифицированных индивидуумов независимо от вида животных и от целей эксперимента.

Создание новых эффективных методов переноса генов в эмбриональные и соматические клетки животных, а также совершенствование существующих подходов и сегодня остается актуальной задачей мировой биологической науки.

Среди большого разнообразия способов внедрения экзогенной ДНК в геном индивидуумов можно выделить следующие, которые нашли широкое применение в практике трансгенеза:

• метод микроинъекции

• опосредованный ретровирусами перенос генов

• перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток

• перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.

Наиболее широко используемым методом трансгенеза в животноводстве является метод микроинъекции.

Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в «суррогатную» мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей транс генных линий.

Степень интеграции, то есть число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах. Так, у мышей этот показатель в среднем составляет 15%, у свиней - 10-15%, у кроликов - 10%, у овец, коз и коров - 5-10%. Наиболее важным, с точки зрения затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель общей эффективности трансгенеза, который рассчитывается как отношение числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов, выраженное в процентах. Следует отметить, что на частоту интеграции при использовании метода микроинъекции оказывают влияние такие факторы, как степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора для микроинъекции, качество эмбрионов, а также способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический).

Результативным способом переноса ДНК в эмбриональные линии животных является применение так называемых ретровирусных векторов. Наиболее часто используемыми ретровирусными векторами являются векторы на основе ретровирусов мыши типа С (вирус лейкемии мыши). Такие векторные системы состоят из двух компонентов: векторной конструкции и линии клеток-упаковщиц.

Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний.

В векторной конструкции (провирусная ДНК) гены, кодирующие структурные белки ретровируса (gag, pol, env), замещают другими интересующими генами (например, генами b-галактозидазы b-gal и устойчивости к неомицину – neo). Источником структурных белков, необходимых для формирования новых инфекционных вирусных частиц, является клеточная линия, содержащая интегрированный в геном провирус.

Преимуществом использования ретровирусных векторов для получения трансгенных животных является то, что до 100% обработанных эмбрионов могут быть успешно инфицированы ретровирусами (http://www.rffi.ru).

Недостатком применения ретровирусных векторов является их ограниченная емкость (размер вставки не должен превышать 8 тысяч п.н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии). Кроме того, хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помошника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретовирусы-помошники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность.

Еще одним способом получения трансгенных млекопитающих является использование трансформированных генными конструкциями клеточных линий. С этой целью могут быть использованы как полипотентные стволовые клеточные линии, так и соматические клетки, культивируемые in vitro. Преимуществом получения трансгенных животных с помощью трансформированных стволовых клеток является возможность тестирования интеграции трансгена в культуре клеток. Это означает, что каждый эмбрион, развившийся в культуре после пересадки ядер, будет трансгенным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется. Кроме того, пересадка таких эмбрионов реципиентам приведет к рождению только трансгенного потомства.

При микроинъекции трансгены наугад интегрируются в любую часть генома. Это означает, что они могут разрушать весьма существенные гены (инсерционные мутации) или размещаться в тех частях хромосомы, которые недоступны для транскрипции.

В 1996 году была продемонстрирована возможность получения жизнеспособных овец посредством пересадки ядер соматических клеток, культивируемых in vitro. Несколько позже та же рабочая группа сообщила о получении трансгенных овец посредством пересадки ядер стабильно трансформированных первичных фетальных фибробластов. Степень трансгенности при использовании данного метода составляла 100%, в то время как применение метода микроинъекции в той же лаборатории позволяло получить лишь 4,35% трансгенных потомков от числа родившихся животных. Как и при использовании ЭСК, данный метод позволяет проводить анализ интеграции в культуре клеток, а также осуществлять целенаправленное встраивание генных конструкций в желаемые участки генома. Кроме того, используемые клеточные линии могут быть кариотипизированы в культуре, что позволит заранее предопределять пол трансгенных животных. После получения трансгенных животных из различных клеточных линий и определения уровня экспрессии может быть произведен отбор желательных клонов для их дальнейшего использования в пересадках ядер .

Еще один способ получения трансгенных животных является перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом. Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 т. п. н.) или фраг­менты генов. Зачастую кДНК плохо экспрссируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последователь­ности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные компле­ксы (>100 т. н. н.) слишком велики для встраи­вания в обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до >1000 т. п. н.

Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примеча­тельный пример трансгеноза с помощью YAC. Моноклональные антите­ла можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить челове­ческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие монокло­нальные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагменты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, техноло­гического прорыва удастся достичь, если ис­пользовать для получения полноразмерных че­ловеческих антител более доступный метод с использованием гибридом.