
- •1.Антгены и иммуногены. Антигенные детерминанты, эпитопы. Гаптены.
- •3.Антиидиотипические и видоспецифические антитела
- •5. Мка получают с помощью гибридомной технологии, а пка выделяют из сыворотки.
- •6. Методы получения антител
- •7. Стадии получения мка и пка
- •9 Требования к свойствам моноклональных антител:
- •10 Вопрос. Гибридомная технология.
- •12.Рекомбинантные иммунотоксины и иммуноферменты. Иммуноадгезины. Абзимы.
- •13 .Селекция методом фагового дисплея.
- •In vitro и in vivo скрининг библиотек фагового дисплея
- •Вопрос15. Антитела и нанотехнологии.
- •Типы наночастиц
- •17)Трансгенные растения и животные – продуценты антител.
- •18. Классификация методов на основе антител
- •19. Прямые и непрямые иммунохимические методы
- •21. Амплификация сигнала и неспецифическое связывание.
- •23. Способы мечения антител и визуализации комплексов антиген-антитело
- •26)Радиоиммунологические методы.
- •27. Виды ифа. Чувствительность анализа, способы её повышения.
- •29. Ифа. Принцип. Конкурентный и «Сэндвич»-ифа.
- •31. Твердофазные виды ифа. Подбор условий методом «шахматной доски»
- •32. Western-блотинг.Dot-blot. Системы детекции и амплифкации сигнала.
- •33.Метод иммунного блоттинга
- •34.Клеточный ифа. EliSpot. Поляризационный флуороиммуноанализ (пфиа).
- •36.Цитофлюориметрия. Популяционный анализ клеток. Клеточный сортинг.
- •37. Клеточное типирование и селекция клеток. Иммуноцитохимия.
- •38.IgA, IgG, IgM: методы определения, реакция агглютинации
- •40. Флуориметрия и методы на ее основе. Флюоресцентная и конфокальная микроскопия. Локализация антигенов.
- •42. Методы, применяемые в иммунодиагностике
- •43. Фагоциты: исследование функций
- •5. Комплемент, лабораторное исследование функций
- •Иммунные комплексы циркулирующие: методы определения
- •45. Методы выявления клеточных антигенов. Маркеры клеточной активации. Дифференцировочные маркеры лейкоцитов.
- •46.Иммунопрофилактика, иммунотерапия, иммунокорекция, иммуномодуляция. Выбор средств, определение вида и способа иммунокорекции.
- •1. Основные виды иммунокорригирующей терапии
- •2. Выбор средств, определение вида и способа иммунокоррекции
- •48. Оценка фагоцитоза, в- и т-систем иммунитета, активности антителобразующих клеток.
- •49)Иммунопроилактика. Вакцины. Виды вакцин. Способы их получения. Успехи применения вакцинации.
- •50)Иммунодифициты: диагностика и иммунотерапия. Оценка иммунного статуса прииммуннодифицитах.
- •51. Стимуляция пролиферации дендритных клеток. Содействие захвату антигена и его процессингу. Стимуляция ответа эффекторных клеток при помощи прямой презентации антигена.
- •52)Направления имуннотерапии рака. Противораковые вакцины.
- •53.Применение имитаторов опухолевых антигенов. Экстрокорпоральная активация противораковых иммунокомпетентных клеток
- •54.Элиминация раковой опухоли с помощью антител. Ангиостатический подход. Использование цитокинов
- •55. Пробиотики, пищевые волокна.
- •56. Применение иммуномодуляторов при иммунодефицитах.
- •59. Критерии выбора методов для исследования, их применение в биологии, экспериментальной и практической медицине и др. Областях
- •60. Иммунологические подходы и методы, применяемые в медицине
7. Стадии получения мка и пка
1) Выбор подходов и средств к иммунизации
Тип АТ (ПКА, МКА) в зависимости от поставленной цели, для которой будут использованы АТ, и теста, в котором они будут применяться
Выбор животного, продуцирующего АТ ( по размеру – в зависимости от типа получаемых АТ – ПКА или МКА, и необходимого количества АТ. Животное должно быть филогенетически удалено от АГ. Выбирают не только по виду, но и специфические линии. Животные должны быть стерильны, т.е. не инфицированы. Как правило, используют самок, т.к. у них лучше выражен иммунный ответ, особенно в период полового созревания. Используют молодых животных)
Выбор типа АГ (иммуногена)
Выбор носителя для гаптена (Носитель должен быть филогенетически удален от иммунизируемого животного, имеет много антигенных детерминант, т.е. и сам является хорошим антигеном и иммуногеном)
2) Подготовка иммуногена
Определение эпитопов АГ (с помощью специальных программ, тестов)
Выделение и очистка АГ – для натуральных, естественных, или синтез пептида/гаптена – для искусственных. Антиген должен быть чистым, без примесей, стерильным (фильтрование через поры диаметром 0,22 мкм). Если синтетический пептид, то в нем не должно быть обширных гидрофобных областей, длинных повторов одной а/к (сер, тре, вал), не должен начинаться и заканчиваться на глу, про, асп.
Сшивка с носителем. Сшивка с носителем химически – с помощью кросс-линкеров. Различные кросс-линкеры используют для сшивки различные группы. Если в качестве АГ используется небольшой пептид, то можно сшить между собой 2 его молекулы с помощью глутарового альдегида. Есть специфические кросс-линкеры, сшивающие аминогруппу одного белка и сульфидную группу другого, т.е. обеспечивают пришивание в определенном положении (сульфо-MSB). Различные кросс-линкеры необходимы для того, чтобы не получить антитела на сам кросс-линкер.
Контроль качества, стерильности (высевом), токсичности (на культуре клеток). Необходимо убедиться, что АГ свободен от липополисахаридов бактерий, полиакриамидного геля, додецилсульфата натрия, мочевины, других органических примесей, чтобы рН не был экстремальным – если надо, то забуферить.
3) Иммунизация
Доза
Периодичность инъекций
Количество инъекций
Способ инъекций
Контроль (отбор проб, титры)
АГ вводится в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней (учитывая схему развития иммунного ответа).
Первая инъекция – премирующая – самая высокая доза АГ, используется полный адъювант Фрейнда. Следующие инъекции – бустирующие (поддерживающие) – уменьшается доза, используется неполный адъювант Фрейнда. Перед забором крови для приготовления сыворотки или перед забором селезенки последние терминальные инъекции делаются с интервалом в 1 день, но минимальной дозой.
Способ инъекции зависит от типа АТ (ПКА или МКА). Для МКА – в перитониум, ближе к селезенке (интраперитониально). Для ПКА – подкожно (у кроликов – в лопатку, бедро).
Забор крови для определения титра АТ у кроликов и мышей – из уха.
4) ПКА – забор крови для приготовления сыворотки. У кролика – из уха, у мыши – из хвоста.
МКА – забор селезенки, гибридомная технология.
5) Очистка АТ
ПКА – аффинная хроматография, истощение сыворотки.
МКА – хроматография, высаливание.
6) Контроль качества АТ
Определение концентрации или титра АТ
Выявление кросс-реактивности
Определение изотипа. С помощью ИФА. Получают АТ к различным типам тяжелых и легких цепей. Изотип записывают в паспорт АТ.
Обычно для МКА эпитопная характеристика – метод взаимодействия с перекрывающимися пептидами.
7) Модификация АТ (метка) осуществляется с помощью кросс-линкеров. Метки: радиоактивные, ферменты, биотин.
8) Хранение
Лиофилизация (высушивание из замороженного состояния) – наилучший способ хранения белка.
Замораживание (-20, -40; -80 – лучшее, т.к. при -80 не действуют протеазы). Модифицированные АТ при замораживании – размораживании могут терять метку, поэтому их хранят при глубоком замораживании с криопротектором.
8. иммунизация. Прививание – в основном 3 раза. BCG. а/г вводиться в 2-3-4 приема с интервалами не менее 20 дней(учитывая схему развития иммунного ответа; чтобы после первого введения развился максимальный, потом сошел на нет).
Подготовка иммуногена. А/г не должен содержать примесей. Рекомбинантные белки- полученные введением чужеродных генов в клетку продуцента. Должен быть стерильным. Белок не должен денатурировать. Эпитоп определили. Необходимо пришить а/г на носитель. Пришивается гаптен химически – кросслинкеры.
Контроль качества, стерильности(высевом), токсичности(на к-ре клеток).