- •Методы исследования в микробиологии
- •Техника безопасности при работе с биологическим материалом
- •Характеристика уровней биобезопасности
- •Забор, хранение и транспортировка материала для микробиологического исследования
- •Микроскопический (бактериоскопический) метод исследования (бсми)
- •1 Этап бсми. Забор, хранение и транспортировка материала.
- •2 Этап бсми. Приготовление микропрепаратов.
- •1) Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в убитом состоянии:
- •Препараты, позволяющие изучать микроорганизмы в живом состоянии:
- •Сложные методы окраски клеточных структур бактерий
- •Сравнение электронного и светового микроскопов
- •4 Этап бсми. Заключение.
- •Культивирование микроорганизмов на питательных средах
- •Классификации питательных сред
- •I. По происхождению:
- •II. По составу:
- •III. По консистенции:
- •IV. По назначению:
- •Наиболее часто используемые индикаторы рН в питательных средах
- •Среды для получения изолированных колоний.
- •Среды для накопления чистой культуры.
- •Среды для идентификации микроорганизмов.
- •Признаки колоний микроорганизмов
- •Методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
- •I. Методы механического разобщения бактерий.
- •Методы выделения чистых культур облигатно-анаэробных микроорганизмов
- •Культуральный (бактериологический) метод исследования
- •I. Этапы блми при выделении чистой культуры аэробов и факультативных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •3 Этап.
- •Признаки, учитываемые при идентификации микроорганизмов (критерии вида)
- •4 Этап.
- •II. Этапы блми при выделении чистой культуры облигатных анаэробов.
- •1 Этап.
- •2 Этап.
- •Биохимическая идентификация микроорганизмов
- •Идентификация микроорганизмов без выделения чистой культуры
- •Принципы молекулярно-генетического анализа
- •Классификация молекулярно-генетических методов
- •Методы, основанные на изучении фрагментов днк.
- •Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.
- •III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.
- •Характеристика стадий пцр
- •IV. Методы анализа амплифицированных фрагментов.
- •V. Методы, основанные на определении последовательности нуклеотидов в днк, рнк и аминокислот в белках.
- •VI. Методы, основанные на модификации генетической информации.
- •Характеристика штаммов e. Сoli, участсвующих в процессе конъюгации
- •Определение факторов патогенности бактерий
- •5. Капсула.
- •7. Изучение неизвестных токсинов и других факторов патогенности микроорганизмов, механизмы действия которых недостаточно изучены.
- •Методы изучения чувствительности бактерий к антибиотикам
- •Классификация методов определения
- •Основные понятия
- •Дискодиффузионный метод
- •Пропорционален антибиотикочувствитель-ности микроорганизма
- •Метод разведений в агаре
- •Метод разведений в жидких средах
- •Ускоренный метод
- •Автоматизированнный метод с использованием автоматических микробиологических анализаторов
- •Генетические методы
- •Состав питательной среды:
- •Величина посевной дозы и состояние тест-микроорганизмов (инокулюм-эффект):
- •Условия инкубации:
- •Биологический (экспериментальный) метод исследования
- •1 Этап эсми. Взятие и обработка материала.
- •2 Этап эсми. Выбор и заражение лабораторного животного.
- •3 Этап эсми.
- •Общие принципы серологического метода исследования
- •Определение активности гуморального поствакцинального индивидуального или коллективного иммунитета;
- •Определение титров диагностических, лечебных и профилактических сывороток;
- •I. Достоинства слми:
- •II. Недостатки слми:
- •Наличие ложных результатов:
- •Общие принципы аллергологического метода исследования
- •I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:
- •Достоинства алми:
- •II. Недостатки алми:
- •Оглавление
Генетические методы
Характеристика методов. Определяют генетические маркеры резистентности.
Особенности методов. Используют ПЦР, ПЦРПДРФ, ДНК-гибридизацию, секвенирование.
Техника проведения. Выделяют ДНК из материала от больных или из чистой культуры микроорганизмов. Проводят генетические исследования. Проводят сравнение с данными фенотипического анализа.
Принцип методов. У резистентных микроорганизмов присутствуют гены, контролирующие синтез ферментов, разрушающих антибиотики. У некоторых микроорганизмов резистентность связана с мутациями в генах, кодирующих структуры, на которые действует антибиотик. Изменение мишени приводит к резистентности (рис. 48).
Оценка чувствительности. Выявление у микроорганизма генетических маркеров резистентности свидетельствует о потенциальной устойчивости к антибиотику.
Оценка методов. Перспективны. На практике используются для диагностики антибиотикорезистентности микобактерий туберкулеза, а также для изучения генетических механизмов устойчивости в рамках регионального или национального мониторинга антибиотикорезистентности.
Рис. 48. Hain тест (реакция гибридизации на мембранах) для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам Mycobacterium spp. (на каждой тест-полоске верхние три горизонтальны полосы являются контролем, остальные свидетельствуют о видовой принадлежности и наличии мутаций в rpoB гене, обуславливающих устойчивость к рифампицину)
Выявление генетических маркёров резистентности целесообразно в тех случаях, когда традиционные фенотипические методы определения чувствительности микроорганизмов неприменимы или недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулёзным препаратам с помощью культуральных методов занимает 48 нед. Кроме того, результаты фенотипических тестов могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов.
Факторы, влияющие на результаты определения антибиотикорезистентности:
Состав питательной среды:
содержание ионов Са2+ (не более 2025 мг/л) и Mg2+ (не более 1012,5 мг/л). Эти ионы инактивируют некоторые антибиотики (тетрациклины), при этом МИК антибиотика повышается;
содержание тимина, тимидина, инактивирующих сульфаниламиды и триметоприм,
рН среды (рис. 49).
Рис. 49. Влияние рН среды на диметры зон задержки роста некоторых антибиотиков
Величина посевной дозы и состояние тест-микроорганизмов (инокулюм-эффект):
культуры, длительное время хранившиеся на плотных или жидких питательных средах, обладают пониженными ростовыми свойствами, поэтому для оценки чувствительности необходимо использовать микроорганизмы, инкубировавшиеся не более 1618 часов;
увеличение концентрации инокулята с 105 КОЕ/мл до 107 КОЕ/мл может приводить к повышению МПК;