Определение факторов патогенности бактерий

1. Б

   

   

   Рис. 41. Негативное контрастирование и электронная микроскопия для выявления жгутиков, пилей, фимбрий (а), инжектосомы 3-ей секреторной системы (б)

   

   Рис. 42. Сканирующая элетронная микроскопия для определения топографии поверхности бактерий

   елки фимбрий, адгезины, компоненты секреторной системы изучают следующим образом:

– клетки дезинтегрируют ультразвуком;

– белки осаждают;

– проводят диализ для освобождения от балласта;

– выделяют очищенный белок при помощи жидкостной хроматографии;

– проводят электрофорез в полиакриламидном геле;

– идентифицируют белок с использованием биомаркеров (меченых поликлональных антител);

– изучают белок: определяют молекулярную массу методом масс-спектрометрии, 3D-структуру методом рентгеноструктурной кристаллографии.

2. Фимбрии выявляют с помощью:

– негативного контрастирования с последующей электронной микроскопией (рис. 41);

– изучения адгезии к поверхности культур клеток Hep2 и др.;

– постановки маннозозависимой реакции гемагглютинации с эритроцитами разных видов животных: при добавлении эритроцитов к суспензии бактерий в присутствии 1% раствора D-маннозы происходит склеивание эритроцитов с образованием «зонтика».

3. Гены, кодирующие бактериальные гликаны (пептидогликан, капсульные полисахариды, липополисахариды, системы гликозилирования белков), определяют с помощью сравнительного компьютерного анализа секвенированного генома микроорганизма и геномов хорошо изученных микроорганизмов. Функции генов подтверждают клонированием этих генов в E. coli или нокаутируют эти гены с использованием сайт-специфического мутагенеза.

4. Поверхностные структуры клеточной стенки изучают с помощью сканирующей атомно-силовой микроскопии высокого разрешения (рис. 42).

5. Капсула.

Наличие капсулы определяют окраской по Бурри-Гинсу (негативное контрастирование), по Книге, в реакции иммунного набухания.

Химический состав капсулы и других гликанов определяют путем разделения компонентов с использованием жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, затем идентифицируют компоненты масс-спектрометрией.

Серологические варианты капсульных антигенов или ЛПС выявляют в серологических реакциях (реакции агглютинации, реакции латекс-агглютинации).

Патогенные свойства капсулы определяют путем введения капсульного вещества лабораторным животным (биологический метод), что может индуцировать образование абсцессов.

6. Токсигенность  свойство бактерий продуцировать и выделять во внешнюю среду экзотоксины (дифтерийный, ботулинистический, токсин Clostridium difficile, холерный, стафилококковый и др.), играющие решающую роль в развитии заболеваний.

Если существует несколько серологических вариантов экзотоксина, то определяют его серотип. Определение серотипа токсина имеет важное значение для назначения адекватной серотерапии (лечения сыворотками). Так при ботулизме определение типа токсина позволяет использовать моновалентную сыворотку и сокращает количество чужеродного лошадиного белка, вводимого в организм. Серотипы экзотоксинов выявляют с использованием одного из следующих методов:

– ИФА;

– реакции преципитации;

– реакции обратной пассивной гемагглютинации;

– иммунохроматографии с использованием антител, меченных коллоидным золотом;

– реакции нейтрализации на животных или в культуре клеток.