Раздел 8

Клеточные реакции иммунитета (1):

Тесты первого ориентировочного уровня (2):

Фагоцитарная активность (3):

В узкую стерильную пробирку наливают 0,2 мл 2%-ного цитрата натрия, 0,1 мл исследуемой крови, взятой из пальца, и 0,5 мл бактериальной взвеси (500 млн м.т. в 1 мл.). В качестве тест-бактерий используют, например, стафилококк или эшерихии. Смесь инкубируют при температуре 37˚С в течение 30 мин, затем готовят мазки, фиксируют в смеси Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимзе. При микроспории подсчитывают не менее 100 нейтрофильных лейкоцитов. Их фагоцитарная активность выражается процентом фагоцитов к общему числу нейтрофилов.

Индексы (4):

Фагоцитарный (5):

Фагоцитарный индекс – это среднее число фагоцитированных бактерий в 1 лейкоците. Для его определения в препаратах подсчитывают 100 нейтрофильных лейкоцитов и количество поглощенных ими бактерий. Фагоцитарный индекс вычисляется делением числа фагоцитированных бактерий на общее число подсчитанных нейтрофилов. Например, 100 лейкоцитов фагоцитировали 540 бактериальных тел – фагоцитарный индекс равен: 540:100=5,4.

Опсонофагоцитарный (6):

Установлено, что в иммунной сыворотке резко повышается титр особых антител, стимулирующих фагоцитоз. Они называются опсонинами. О содержании их в крови можно судить по опсонофагоцитарному индексу, который вычисляется делением фагоцитарного индекса иммунной сыворотки на соответствующий индекс нормальной.

Опсонофагоцитарная проба (7):

Более достоверные данные об опсонизирующих свойствах сывороток получают в опсонофагоцитарной пробе. Ее ставят следующим образом: в небольшую пробирку последовательно наливают 0,25 мл 2%-ного раствора натрия цитрата, 0,25 мл крови и 0,25 мл двухмиллиардной взвеси возбудителя. Пробирку помещают на 30 мин при температуре 37˚С в термостат, затем готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом и окрашивают по Романовскому-гимзе. В препаратах подсчитывают количество микроорганизмов, фагоцитированных 25 нейтрофилами.

Для оценки опсонофагоцитарной пробы предложен числовой показатель, представляющий собой сумму произведений, полученных в результате умножения количества лейкоцитов на соответствующее число плюсов, характеризующих интенсивность фагоцитоза. Показателем завершенности фагоцитоза может явиться количество деградированных бактерий в расчете на 100 лейкоцитов, но самым точным его индиктором будет отсутствие роста бактерий на питательной среде, засеянный лейкоцитарно-бактериальной массой, которая использовалась для вычисления цифрового показателя опсонофагоцитарной пробы.

Тесты второго аналитического уровня (методы определения) (8):

Функциональной активности фагоцитов (9):

Степень функциональной активности фагоцитов на первых стадиях фагоцитоза определяют по хемотаксическому индексу, исследуя скорость передвижения фагоцитов к хемотрактанту м проникающую их способность сквозь мелкопористые фильтры, а на последующих – микробоцитарную активность пероксидазы, суперксиддисмутазы, лизоцима, кислой и щелочной фосфатаз.

Количества и функционального состояния (10):

В-лимфоцитов (реакции) (11):

В периферической крови В-лимфоциты обнаруживают по наличию у них рецепторов к 3-й фракции комплемента (реакция ЕАС-розеткообразования), иммуноглобулиновых рецепторов (реакция иммунофлюоресценции), рецепторов к эритроцитам мыши (реакция МЕ-розеткообразования).

ЕАС-розеткообразования (12):

Ставится в два этапа: вначале готовят реагент, состоящий из эритроцитов быка, антител к ним и комплемента, после чего иммунный комплекс прибаяляют к лимфоцитам крови человека – на внешней мембране В-клетки образуется розетка из нескольких эритроцитов.

Иммунофлюоресценциии (13):

Используются антиглобулиновые сыворотки, меченные люминофорами.

МЕ-розеткообразования (14):

Используются мышиные эритроциты, сорбирующиеся в виде розеток на лимфоцитах периферической крови.

Радиальной иммунодиффузии на агаре (15):

Применяя метод, на стеклянную пластину наливают агар, содержащий антитела к тому или иному классу иммуноглобулинов. После застывания агара выбитые в нем лунке заполняются исследуемыми сыворотками. В результате иммунопретипитации вокруг них образуются радиальные полоски, диаметр которых зависит от концентрации соответствующего иммуноглобулина.

Т-лимфоцитов (реакции) (16):

Е-розеткообразования (17):

Используют плазму крови человека и эритроциты барана. Плазму получают из венозной гепаринизированной крови (20-30 ЕД гепарина/мл). При этом для ускарения оседания эритроцитов кровь помещается в термостат при температуре 37˚С на 30-60 мин. Второй ингридиент реакции – эритроциты от нескольких баранов трижды отмываются изотоническим раствором хлористого натрия и разводятся средами Хенкса или 199-й до 1%-ной концентрации.

Бластной трансформации (18):

Реакция проявляется с фитогемааглютинином или соответствующими антигенами. При этом они превращаются в крупные молодые клетки – бласты, процент которых вычисляют, подсчитывая а препарате не менее 200 лимфоцитов.

Фенотипирвоания (19):

Для определения CD4⁺-Т-хелперов и CD8⁺-Ткиллеров используются фиксированные на эритроцитах или частицах латекса моноклональные антитела против CD3, CD4, CD8 молекул, для определения В-лимфоцитов к CD22 или CD19, для выявления NК-клеток – к CD16 или CD56.

Суммарного количества (20):

Т-лимфоцитов в реакции розеткообразования (21):

Схема исследования:

1. Для получения т-лимфоцитов плазму по стенке пробирки наслаивают на фиколл-верографин с градиентом плотности 1,077 в соотношении 4:1 по объему. Пробы центрифугируют при комнатной температуре 25 мин при 400 g. Полученное кольцо мононуклеаров отсасывают в пробирку с 2 мл среды Хенкса и вновь центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин.

2. Осадок лимфоцитов взвешивают в среде хенкса, разводят до концентрации 10-15 клеток на большой квадрат камеры Горяева и в объеме 50 мкл вносят в лунки круглодонной планшеты, прибавляя к ним такой же объем эритроцитов барана.

3. для более тесного взаимодействия между лимфоцитами и эритроцитами планшета 3-5 мин центрифугируется при 1000 об/мин и помещается в холодильник на 1 час при 4˚С.

4. Удалив надосадочную жидкость, в лунки вносят по 50 мкл 1%-ного глютарового альдегида на фосфатном буфере (по 0,4 мл на 10 мл буфера). Смесь выдерживается 10 мин, ресуспендируется автоматической микропипеткой, и полученная суспензия наносится на предметные стекла.

5. мазки сушат, красят пиронин-метиловым зеленым и подсчитывают 100 лимфоцитов, определяя процент розеткообразующих.