Методи визначеня ферментативних активностіей Методи визначення активності амілолітичного комплексу

Всі ферменти амілолітичного комплексу належать до класу гідролаз, другому підкласу - ферментам, які каталізують гідроліз глікозидних сполук і підпідкласу глікозидаз.

У комплекс ферменту амілолітичної дії входять - і -амілази, глюкоамілаза і комплекс ферменту, котрий зветься декстриназою.

-амілаза /-І, 4-глюкан-глюканогідролаза,3.2.1.1/ каталізує розрив внутрішніх -1,4-глюкозидних зв‘язків крохмалю, тому її називають ендоамілазою. При дії -амілази проходить розжиження крохмалю внаслідок накопичення декстринів і деякої кількості мальтози.

-амілаза /-1,4-глюкан-мальтогідролаза,3.2.1.2/є ферментом екзодії і гідролізує -1,4-глюкозидні зв‘язки, і передостанні у лінійних ділянках амілози і амілопектину, послідовно відщеплюючи залишки мальтози із неридукуючого кінця ланцюга. При цьому шляхом інверсії утворюється -мальтоза.

Глюкоамілаза або екзо-1,4-глюкозидаза /-1,4-глюкан-глюкогідролаза, 3.2.1.3/ також є екзоферментом, гідролізує крохмаль, відщеплюючи послідовно залишки глюкози із неридукюючого кінця ланцюга. Фермент має схожість не тільки до -1,4-глюкозидних зв’язків, але і до -1,6-зв‘язків, які гідролізуються із значно меншою швидкістю.

Декстриназа  комплекс ферментів, котрі діють на розгалужені субстрати із великою кількістю -1,6-зв‘язків.

2.1.1.Визначення амілолітичної активності колориметричним методом /ас/.

Метод заснований на гідролізі крохмалю ферментами амілолітичного комплексу до декстринів різної молекулярної маси. Кількість гідролізованого крохмалю встановлюють за зміною його кольору з йодом в результаті дії амілаз. Інтенсивність кольору з йодом вихідного крохмалю та отриманих в результаті гідролізу декстринів вимірюють на фотоелектроколориметрі.

За одиницю амілолітичної активності /АС/ прийнято таку кількість ферменту, яку в строго визначених умовах каталізують гідроліз 1г розчинного крохмалю до декстринів різної молекулярної маси. При цьому кількість прогідролізовагого крохмалю має складати не більше 30% від вихідного.

Активність препарату /амілолітична здатність/ виражається числом одиниць активності в 1г препарату.

Колориметричний метод визначення амілолітичної активності затверджений ГОСТ 20264.4-74.

Хід роботи

Ферментативну реакцію гідролізу крохмалю проводять в строго визначених стандартних умовах: температура-30⁰С, рН середовища-6,0 для бактеріальних препаратів та 4,7- для грибкових, тривалість реакції 10хв, концентрація субстрату 1%, об‘єм реакційної суміші 15мл /10мл субстрату та 5мл ферментного розчину/.

Для аналізу беруть дві пробірки діаметром 2см та висотою 18см, наливають в кожну по 10мл 1%-го розчину крохмалю і ставлять в ультратермостат з температурою 30⁰С на 10-15хв, щоб розчин досягнув температури 30⁰С.

Потім в першу пробірку наливають 5мл дистильованої води /контрольний зразок/, в другу- 5мл ферментного розчину /дослідна проба/. Суміші швидко перемішують та витримують в ультратермостаті 10хв для проведення ферментативної реакції. Потім пробірки виймають з термостату, з кожної відбирають по 0,5мл реакційної суміші і переносять в конічні колбочки, в які попередньо налито по 50мл робочого розчину йоду. Вміст колб перемішують; проходить одночасно інактивація ферменту та йод-крохмальна реакція.

Розчини отримають окраску: контрольна проба  синю, досвідна  фіолетову різної інтенсивності в залежності від ступеню гідролізу крохмалю.

Оптичні густини отриманих забарвлених розчинів визначають на фотоелектроколориметрі, використовуючи кювети з товщиною стінки 10 мм та світофільтр з довжиною світової хвилі 656нм /червоний світлофільтр/.

Виміри проводять по інструкції, прикладеної до кожного приладу. Відлік знімають по червоній шкалі лівого барабану. Отримують два значення оптичної густини: D₁- контрольного розчину, яка характеризує кількість крохмалю, взятого на ферментативну реакцію (значення D₁ має бути не менше 0,7) та D₂- досвідного розчину, яка характеризує кількість крохмалю та декстринів в реакційній суміші.

Кількість прогідролізованого крохмалю С в г визначається за формулою:

.

Якщо кількість прогідролізованого крохмалю менше 0,02 або більше 0,7, то аналіз повторюють відповідно з більшим або меншим розведенням вихідного ферментного розчину. Амілолітичну активність визначають з рівнянь, отриманих при математичній обробці експериментальних даних по вивченню залежності між кількістю взятого на аналіз ферменту та ступінню гідролізу крохмалю /в коефіцієнти введено перерахунок на 1год дії ферментів/.

Внаслідок різниць ферментних комплексів препаратів грибкового та бактеріального походження і специфічності їх дії розрахунок активності проводиться по рівнянням, які характерні тільки для аналізу даного роду ферментних препаратів.

Рівняння для розрахунку амілолітичної активності має вигляд:

для препаратів грибкового походження:

ОД/г; /І/

для препаратів бактеріального походження:

ОД/г, де /2/

С - кількість крохмалю, прогідролізованого в період реакції, г;

n- кількість ферментного препарату, взятого на аналіз, мг.

Для вираження амілолітичної активності в міжнародних одиницях отриману величину АС слід помножити на 103 стандартних міжнародних одиниць розмірністю мкмоль/хв.

Приклад розрахунку. Для аналізу беремо препарат амілорізин П10х готуємо з нього розчин. Для цього наважку 0,1г препарату переносимо в мірну колбу на 100мл і розчиняємо в дистильованій воді. Розчин доводимо до мітки теж дистильованою водою. З цього розчину готуємо робочий розчин. Для робочого розчину 2мл вихідного розчину поміщаєм в мірну колбу на 200мл і доводимо до мітки дистильованою водою. Для аналізу беремо 5мл робочого розчину в якому знаходиться 0,05 мг амілоризину П10Х. Аналіз проводимо повністю так, як приведено вище.

В результаті отримані значення оптичної густини:

D₁=0,745 і D₂=0,463.

Кількість прогідролізлваного крохмалю

г.

Тоді активність даного препарату буде

ОД/г.

Реактиви.

1.Розчин крохмалю 1% /субстрат/.

2.Ацетатний буферний розчин з рН=4,7.

3.Фосфатний буферний розчин з рН=6,0.

4.Основний розчин йоду І₂.

5.Робочий розчин йоду.

Посуд та обладнання

1.Ваги та гирі

2.Пробірки Ø=20мм, h=180мм

3.Піпетки на 1, 5 і 20 мл

4.Ультратермостат на 30^оС

5.Секундомір

6.Колби конічні на 100-250 мл

7.Мірні колби на 50 мл

8.Фотоелектроколориметр

9.Кювети з товщиною стінки 10 мм

Література:И.Грачёва и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. С.57