Построение калибровочного графика

Построить калибровочный график зависимости оптической плотности дрожжевой суспензии D от концентрации биомассы суспензии Х.

Для этого следует приготовить модельные суспензии с концентрациями биомассы, указанными в первой строке таблицы, провести измерения их оптической плотности и заполнить вторую строку таблицы. По результатам измерений построить калибровочный график D=f(X).

Х, г АСБ/л	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,8
D	0

Для измерения оптической плотности использовать фотоэлектроколориметр с установкой длины волны проходящего света λ=490 нм для кюветы с толщиной рабочего слоя образца 5 мм.

Условия культивирования

Культивирование ведут на перемешивающем устройстве (качалке). В процессе ферментации поддерживают следующие условия: температура 36^о С, число оборотов качалки 200-220 мин^-1. Длительность ферментации составляет 24 часа. Отбор проб в первые 6-8 часов производят через каждые 1,5-2 часа, причем первая проба отбирается сразу после посева культуры в питательную среду. Последняя проба отбирается по истечении 24 часов культивирования.

В каждой пробе определяют оптическую плотность и, пользуясь калибровочным графиком, определяют концентрацию биомассы дрожжей. Далее рассчитывают содержание белка в биомассе, а также определяют концентрацию этанола и глюкозы по методикам, указанным ниже.

Пользуясь препаратом дрожжевой суспензии «раздавленная капля», в рабочих тетрадях изображают морфологическую картину для каждой отобранной пробы и анализируют наличие гликогена в клетках дрожжей.

Методы аналитических исследований

Определение оптической плотности культуральной жидкости

Оптическая плотность служит качественным показателем содержания биомассы в культуральной жидкости. Для определения оптической плотности применяют фотоэлектроколориметр. При приготовлении суспензии клеток учитывают, что наиболее точные результаты получают при работе с суспензиями, имеющими показатели на среднем участке измерительной шкалы. Для разбавления суспензий используют водопроводную воду. Измеряют светорассеяние суспензий с помощью кюветы с длинной светового пути 0,5 см при длине волн 490 нм (зеленый светофильтр).

Подсчет числа клеток в культуральной жидкости производят с помощью счетной камеры Горяева-Тома, при микроскопировании проб с 40‑кратным объективом.

Определение содержания этанола.

1. Для качественного определения этанола проводится следующий анализ проб микробной суспензии:

1 мл КЖ (отфильтрованная проба) + 0,2 мл 2% К₂Cr₂О₇ + 1 мл Н₂SО₄ (конц.)→

Цвет раствора характеризует степень присутствия этанола в пробе:

голубой цвет – много этанола

зеленый цвет – достаточное количество этанола

желтый цвет – отсутствие этанола.

2. Для количественного определения содержания этанола могут быть применены 2 метода.

2.1. Метод газохроматографический.

Определение производят с помощью газового хроматографа снабженного пламенно-ионизационным детектором. В качестве сорбента используют PORAPAC-QS, в процессе определения поддерживают температуру колонок 180^о С. В качестве газа-носителя применяют инертные газы (гелий или азот). Температура испарителя – 220^о С. При расходе газа‑носителя 4,2 л/мин этанол регистрируется на 5-6 минуте после ввода пробы. Для контроля вводят определенное количество этанола и по соотношению высоты пиков контроля и пробы судят о концентрации этанола в среде.

2.2. Оксидиметрический метод основан на окислении этанола до уксусной кислоты и воды смесью бихромата калия с серной кислотой.

3СН₃СН₂ОН + 2К₂Cr₂О₇ + 8Н₂SО₄ → 3СН₃СООН + 2Cr(SO₄)₂ + K₂SO₄ + 11H₂O

Избыток бихромата оттитровывают раствором соли Мора.

К₂Cr₂О₇ + 6FeSO₄×(NH₄)₂SO₄ + 7Н₂SО₄ → Cr₂(SO₄)₃ + 3Fe₂(SO₄)₂ + + 6(NH₄)₂SO₄ + 7H₂O + K₂SO₄

По количеству бихромата, израсходованного на окисление, вычисляют концентрацию этанола.

Для определения концентрации этанола в мерную колбу вносят 20 мл культуральной жидкости, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Затем отбирают 10 мл пробы в круглодонную колбу емкостью 50-75 мл, горлышко плотно закрывают резиновой пробкой с вмонтированной в нее газоотводной трубкой. В трехгорловую колбу вносят 25 мл раствора бихромата и 10 мл концентрированной серной кислоты. Конец отводной трубки должен доходить почти до конца приемника. Отгонка длится 10-15 минут. За время отгонки приемная колба должна быть заполнена на 2/3 объема колбы. Окраска раствора меняется от оранжевой до грязно-бурой. Содержимое приемника переносят в мерную колбу на 100 мл, туда сливают промывные воды от приемника и отводной трубки, доводят до метким дистиллированной водой и перемешивают. Отбирают 20 мл в коническую колбу на 250 мл, добавляют туда 20 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора.

Одновременно ведут контрольное титрование следующим образом. В коническую колбу на 250 мл помещают 5 мл раствора бихромата, 2 мл концентрированной серной кислоты, 30-40 мл дистиллированной воды и титруют раствором соли Мора. Конец титрования устанавливают капельной пробой с раствором феррицианида. Ее проводят на белой фарфоровой пластинке с помощью стеклянной палочки. Капают по капле раствор феррацианида и титруемую жидкость. Интенсивное синее окрашивание свидетельствует о конце титрования. Количество этилового спирта в г/л культуральной жидкости рассчитывают по формуле

n = ,

где а, в – количество раствора соли Мора, пошедшего на титрование контрольной и опытной пробы соответственно;

25 – количество К₂Cr₂О₇ в мл;

5 – разведение культуральной жидкости;

0,01 г этанола соответствует 1 мл К₂Cr₂О₇.

Необходимые растворы: Н₂SO₄ (уд. вес 1,84), раствор К₂Cr₂О₇ – 42,6 г/л, раствор соли Мора FeSO₄×(NH₄)₂SO₄ – 92 г и Н₂SO₄ – 20 г в 1 л воды, раствор феррицианида – 0,2 г/л.

Определение содержания глюкозы в питательной среде и культуральной жидкости (по реакции Фелинга)

Метод основан на восстановлении меди моносахаридами из окиси меди (II) в окись меди (I). Моносахариды в этой реакции выступают в качестве восстановителей меди и поэтому называются редуцирующими веществами (англ. reduction - восстановление). При проведении реакции используется реактив Фелинга, представляющий собой смесь растворов сульфата меди и сегнетовой соли (калий натрий виннокислый) в щелочной среде. При смешивании сульфата меди со щелочью происходит реакция:

CuSO₄ + 2NaOH→ Cu(OH)₂ + Na₂SO₄

В присутствии сегнетовой соли выделившийся гидрооксид меди (II) не выпадает в осадок, так как образует комплексное соединение. Медь (II) восстанавливается в присутствии моносахаридов с образованием окиси меди (I). Количество выпадшего осадка Сu₂O (красно-бурого цвета) зависит от природы и количества редуцирующих веществ в пробе, состава жидкости Фелинга, ее щелочности, общего объема нагреваемой жидкости, температуры и длительности нагревания.

В результате этой реакции альдегидная или кетонная группа моносахарида окисляется до карбоксильной группы:

В зависимости от содержания углеводов в исследуемой жидкости, для анализа надо брать следующее количество пробы:

а) до 30 часов роста культуры – 0,5 мл

б) до 48 часов роста культуры – 1 мл

Для анализа отобрать 0,5 мл культуральной жидкости в колбу объемом 100 мл (250 мл), добавить 9,5 мл H₂O и по 10 мл растворов Ф1 (CuSO₄× 5H₂O) и Ф2 (COOK ─ CHOH ─ CHOH ─ COONa × 4H₂O), и смесь нагревают на электроплитке в течение 3 минут с момента появления первого пузырька. Затем смесь охлаждают и в колбу вносят 15 мл 20% раствора H₂SO₄ и 5 мл 40% раствора KJ. Выделившийся J₂, оттитровывают 0,1 н раствором Na₂S₂O₃. В конце титрования вносят в колбу несколько капель 0,5% раствора крахмала. Крахмал нужно добавлять в конце титрования, т.к. если добавлять его сразу, то образуется комплекс меди с крахмалом, который медленно реагирует с гипосульфитом натрия (Na₂S₂O₃). Раствор в колбе должен приобрести сначала грязно-синий цвет, а по окончании титрования молочную окраску.

Аналогично готовят контрольный пробу, в которой вместо культуральной жидкости для анализа используется 10 мл H₂O. Далее реакцию проводят согласно вышеописанной методике.

Используя данные титрования и учитывая разность объемов титранта (Na₂S₂O₃) между контрольной и опытной пробами (ΔV), по калибровочному графику ΔV = f (С) определяем концентрацию редуцирующих сахаров (С). Этим методом определяют содержание в культуральной жидкости гексоз – основного источника углерода для большинства микроорганизмов.

Выявление запасного энергетически важного запасного вещества дрожжевой клетки – гликогена

На предметном стекле приготовить препарат «раздавленная капля». Добавить каплю раствора Люголя. Микроскопировать под увеличением в 40 раз. Гликоген в дрожжевых клетках окрашивается в красновато-бурый цвет.

Определение количества белка в биомассе

Метод основан на том факте, что спектрофотометрически максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм. Он обусловлен присутствием в белках ароматических аминокислот – тирозина и триптофана. Диапазон колебаний отношений их содержания к содержанию других аминокислот довольно узок.

При определении содержания белка в дрожжевых клетках сначала проводят гидролиз дрожжей с экстракцией белков. Для этого надо внести 1 мл культуральной жидкости в мерные колбы на 50 мл, добавить 20 мл 0,5 н NаОН и поставить на кипящую водяную баню и нагревать. Время закипания засекают с момента закипания. Затем пробы охлаждают и доводят объем до 50 мл 0,5 н раствором NаОН. Остатки клеток удаляют центрифугированием. Одновременно обрабатывают контрольную пробу. Для этого нужно внести 20 мл 0,5 н NаОН, прокипятить на водяной бане 20 минут, довести объем до 50 мл 0,5 н NаОН.

В фугате определяют с помощью спектрофотометра оптическую плотность при λ = 280 нм и 260 нм. При каждой длине волны измерения проводят относительно контрольной пробы.

Если отношение ≤ 1,70, то концентрацию белка определяют по формуле: Б = 1,45 А₂₈₀ - 0,74 А₂₆₀. Здесь А₂₈₀ и А₂₆₀ – оптическая плотность при 280 и 260 нм соответственно; Б – содержание белка в биомассе, % вес.

Зная концентрацию биомассы в культуральной жидкости, можно определить концентрацию белка в биомассе.