Актуальность проблемы

Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии, например, путем участия в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002).

Организмы адаптируются к меняющимся условиям окружающей среды путём изменения экспрессии (скорости транскрипции) генов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. При этом может происходить включение или выключение транскрипции. Эукариотические клетки используют тот же самый принцип, хотя в регуляции реализуются и некоторые другие более сложные механизмы. (http://biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Part31-185.html)

Экспрессия генов

При репрессии трансляции, на некоторых этапах развития живых организмов, особенно на стадии морфогенеза и поддержания клеток в недифференцированном состоянии (например, в случае стволовых клеток), важное значение имеют эндогенно экспрессируемые микроРНК, которые являются продуктами интронных и межгенных участков. Роль таких эндогенно экспрессируемых микроРНК в подавлении экспрессии генов была впервые описана у нематоды Caenorhabditis elegans в 1993 году. У растений такая функция микроРНК была впервые описана на модельном объекте Arabidopsis thaliana, для которого было показано влияние «JAW микроРНК» на регуляцию нескольких генов, контролирующих внешний вид. У растений гены, регулируемые микроРНК, как правило, являются факторами транскрипции, поэтому микроРНК регулируют целые генные сети, изменяя экспрессию ключевых генов (в том числе, факторов транскрипции и белков F-box) в ходе эмбрионального развития. У многих организмов, в том числе и у человека, микроРНК принимают участие в образовании опухолей и нарушении регуляции клеточного цикла. В данном случае микроРНК могут являться как онкогенами, так и супрессорами опухолей.

Последовательности малых интерферирующих РНК и микроРНК комплементарны последовательностям нуклеотидов прототорных участков. Связывание siRNA и микроРНК с этими участками может приводить к повышению транскрипции генов и активации РНК. Увеличение экспрессии данных генов происходит при участии белков Dicer и Argonaute, также происходит деметилирование гистонов.

Выключение генов

Система РНК-интерференции часто используется в экспериментальной биологии для изучения функции генов в культурах клеток и в модельных организмах in vivo. Синтетическую двуцепочечную РНК, комплементарную заданному гену, вводят в клетку или организм, где чужеродная молекула РНК запускает систему РНК-интерференции. Этот метод позволяет исследователям значительно снижать уровень экспрессии соответствующего гена. Изучение последствий снижения экспрессии интересующего гена позволяет выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Так как система РНК-интерференции не может полностью выключить экспрессию гена, данный метод называется «нокдауном гена» — в отличие от полного удаления гена, «нокаута гена».

Значительные достижения в области вычислительной биологии позволяют разрабатывать двуцепочечные РНК, которые обеспечивают максимальное снижение экспрессии гена-мишени и обладают минимальными побочными эффектами. Побочные эффекты могут возникать в случае, когда вводимая молекула РНК имеет последовательность, комплементарную нескольким генам одновременно, что приводит к снижению экспрессии нескольких генов на недостаточную величину. Подобные трудности возникают часто в случае, когда двуцепочечная РНК содержит повторяющие последовательности. Изучение геномов Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, и Schizosaccharomyces pombe показало, что около 10 % молекул малых интерферирующих РНК будут приводить к значительным побочным эффектам Разработано значительное количество компьютерных программ для подбора последовательностей малых интерферирующих РНК, в том числе, специфичных для млекопитающих и вирусов. Предлагаемые последовательности siRNA автоматически проверяются на перекрёстную активность.

В зависимости от организма и экспериментальной системы, экзогенные РНК могут быть сконструированы длинными и являться мишенью белка Dicer, либо короткими и являться субстратами малых интерферирующих РНК. Для большинства клеток млекопитающих предпочтительнее использовать более короткие РНК, так как длинные двуцепочечные РНК у млекопитающих вызывают интерфероновый ответ, форму врожденного иммунитета, неспецифической реакции на чужеродный генетический материал. Для ооцитов мыши, а также для клеток эмбрионов мыши на ранних стадиях развития интерфероновый ответ на экзогенные двуцепочечные РНК не характерен, поэтому эти клетки являются удобной системой изучения нокдауна генов у млекопитающих. Для использования системы РНК-интерференции в лабораторных условиях были разработаны специальные методы, не требующие прямого введения малых интерферирующих РНК в клетку, например, системы трансфекции плазмидой, кодирующие транскрибируемые последовательности siRNA, лентивирусные векторы, позволяющие индуцировать или инактивировать транскрипцию, называемые также англ. conditional RNAi.

Современные подходы к диагностике и терапии латентной хламидийной инфекции урогенитального тракта

http://www.mediasphera.ru/journals/vestnik/detail/115/1318/

С помощью метода ОТ-ПЦР также проводилось исследование биопсийных проб синовиальных тканей больных реактивным артритом. Показано наличие в ткани метаболически активных хламидий, при этом в них наблюдался высокий уровень транскрипции белка теплового шока при отсутствии транскриптов гена MOMP, что позволило сделать вывод о наличии персистирующей формы инфекции.За последние 2 года, после определения полной нуклеотидной последовательности генома C. trachomatis и C. pneumonia, найдено уже достаточное число молекулярных маркеров различных стадий жизненного цикла хламидий. Для стадии мультипликации - размножения РТ - характерны, например, экспрессия генов транскрипционных факторов сигма-28 и сигма-66, а также гена FtsK, который требуется для деления клеток. Недавно показано, что транскрипция FtsK может служить также маркером персистенции, так как при переходе культуры в персистирующее состояние, когда ретикулярные тельца только увеличиваются в размерах, но не размножаются, его транскрипции не происходит. На стадии созревания - перехода РТ в ЭТ - экспрессируются гены позднего оперона CRP, которые обеспечивают жесткость оболочки ЭТ, транскрипционный фактор сигма-56, ДНК-связывающие и гистоноподобные белки hstA и hstB, участвующие в конденсации хроматина.При исследовании клинического штамма, устойчивого к высокой концентрации доксициклина, в нем обнаружено существенное снижение уровня транскрипта гена CRP, что свидетельствует о значительных сдвигах в цикле развития данного изолята по сравнению с лабораторным штаммом.Таким образом, можно предположить, что изучение транскрипции различных генов при действии на хламидию антибактериальных агентов может дать существенную информацию об их эффективности, становится также возможной оценка влияния на бактерию субингибиторных концентраций антибиотика.

http://www.cerebellum.ru/basis.php

1. Мозг – орган, экспрессирующий наибольшее число генов организме. На молекулярном уровне специфичность каждой из клеток организма создается составом белков, из которых она построена и которые обеспечивают ее функции. Эти белки синтезируются за счет активности генов в составе ДНК, содержащейся в ядре клетки - в геноме организма. Синтез белка посредством считывания информации с гена в виде молекулы матричной РНК (мРНК) и ее трансляции в белковую молекулу называется экспрессией гена. В каждой клетке экспрессируются далеко не все гены, а только определенная их часть, которая и определяет молекулярную специфику ее композиции и функций. Обычно, для построения того или иного органа достаточно экспрессии в его клетках лишь нескольких процентов от общего числа генов в геноме.

Один из важнейших фактов, обнаруженный молекулярной генетикой мозга, состоит в том, что число генов, активных в мозге млекопитающих, значительно превосходит количество генов, экспрессирующихся во всех других органах и тканях. Еще первые работы по оценке сложности состава мРНК в мозге мышей установили, что она огромна и приближается почти к 120 млн. нуклеотидов, по сравнению, к примеру, с приблизительно 30 млн. нуклеотидов в мРНК печени и почки. Позже, методами молекулярного клонирования удалось вычислить, что из приблизительно 80-100 тыс. генов составляющих геном крысы, около 50-60 тыс. экспрессируются в мозге, причем экспрессия более половины из них мозгоспецифична. Это в несколько раз превышало число генов, активных в печени, почках, селезенке или сердце. В действительности, молекулярный репертуар мозга может быть даже еще больше. Продукты многих мозгоспецифических генов подвержены альтернативному сплайсингу - экспрессия гена в разных клетках может давать различные белки за счет использования разной комбинации функциональных блоков одного и того же гена.

Человеческий мозг подчиняется такой же закономерности. Анализ тканеспецифичности экспрессии случайным образом выбранных 2505 генов из кДНК библиотеки мозга человека показал, что половина исследованных генов имеет мозгоспецифическую экспрессию. Этот расчет находит независимое подтверждение, происходящее из медицинской генетики. Приблизительно 50% из реестра генетических заболеваний человека содержат те или иные симптомы нарушений функций нервной системы. Таким образом, и у человека как минимум каждый второй ген связан с обеспечением той или иной функции нервной системы.

Одним из первых в данной группе был клонирован ген c-fos. Его структура и свойства хорошо изучены, и он может служить прототипом генов данного семейства. Первоначально было установлено, что в ходе эмбрионального развития c-fos играет важную роль в регуляции процессов клеточного роста и пролиферации. Гены, экспрессия которых находится под контролем индуцируемых транскрипционных факторов, были названы, по аналогии с вирусными системами, "поздними" генами, "генами позднего ответа" или "эффекторными" генами, а весь двухфазный механизм регуляции транскрипции с участием этих двух классов генов является одним из наиболее универсальных способов обеспечения процессов клеточного деления и роста в развитии.

В середине 1980-х годов несколько исследовательских групп обнаружили экспрессию гена c-fos в мозге обучающихся взрослых животных. Прямое подтверждение критической роли экспрессии гена c-fos в формировании памяти дали эксперименты с избирательной блокадой его активности мозге. Эти опыты показали, что подавление трансляции мРНК c-fos в структурах мозга нарушает долговременную, но не кратковременную память в различных моделях обучения и у разных видов животных.

На молекулярно-генетическом уровне научение составляет с развитием единый континуум. Таким образом, при научении в нервных клетках наблюдается следующая последовательность молекулярно-генетических процессов. Вначале рассогласование текущей ситуации с имеющимся опытом запускают активацию каскада "ранних" регуляторных генов в группах клеток опосредующих эти процессы. Продукты "ранних" генов индуцируют, в свою очередь, экспрессию "поздних" генов, в том числе генов морфорегуляторных молекул, являющихся ключевыми участниками процессов морфогенеза при эмбриональном развитии. Эти и другие эффекторные гены стабилизируют участие нейронов в новой, сложившейся в результата обучения, функциональной системе. При этом основные молекулярно-генетические элементы и этапы молекулярного каскада дифференцировки клетки оказываются чрезвычайно сходными при научении и развитии. В определенном смысле мы можем сказать, что на молекулярном уровне научение выступает как непрекращающийся процесс развития. Однако механизмы регуляции экспрессии генов при научении имеют одно чрезвычайно важное отличие от сходных процессов в развитии.

Мышей помещали в камеру, где они получали серию неизбегаемых электрокожных раздражений. Это вызывало у них массивную активацию экспрессии гена c-fos в ряде структур головного мозга - коре, гиппокампе и мозжечке. Однако, после того как животных регулярно подвергали этому воздействию на протяжении 6 дней, в конце концов та же самая процедура, связанная с аверсивной стимуляцией, переставала вызывать активацию c-fos в клетках мозга. Хотя животные продолжали подвергаться электрокожному раздражению, это воздействие утеряло свою новизну и перешло в категорию ожидаемых событий в системах их индивидуального опыта. Таким образом, экспрессия c-fos в данных условиях вызывается вовсе не внешними стимулами, действующими на мозг, а их несоответствием материалу инидивидуальной памяти. Наиболее демонстративно это можно было увидеть на животных специальной группы, которым наносили раздражение на протяжении пяти дней, а на шестой день помещали их в ту же камеру, но электрокожную стимуляцию они в ней не получали. Это отсутствие стимуляции вызывало на первый взгляд парадоксальный эффект - животные данной группы демонстрировали значительную активацию экспрессии гена с-fos в мозге, особенно в гиппокампе.

Следовательно, взаимоотношение процессов развития нервной системы и научения требует описания на двух различных уровнях. На уровне регуляции экспрессии генов научение действительно составляет с развитием мозга единый континуум. В обоих случаях дифференцировка нервных клеток зависит от активации в них определенных транскрипционных факторов. Некоторые из этих белков кодируются семейством "ранних" генов. Активация этих генов и в развивающемся и обучающемся мозге осуществляется посредством факторов роста, медиаторов и гормонов. Вслед за экспрессией транскрипционных факторов наступает вторая волна активации "поздних" или эффекторных генов.

Наследственные Болезни и НОХ Гены

http://mglinets.narod.ru/syndroms2/HOXdisease.htm

Группа генов, известная как гомеобоксные гены, является важной для регуляции развития. Эти гены высоко законсервированы в ходе эволюции. Они экспрессируются во время эмбрионального развития высоко скоординированным образом и продолжают экспрессию практически во всех тканях и органах во взрослой жизни. Homeobox {Hox) гены были обнаружены благодаря наблюдениям над интересными мутациями у плодовой мушки, Drosophila melanogaster. Мутация antennapedia трансформировала антенны в ноги, тогда как мутация bithorax гальтеры (балансирующий орган в третьем торакальнои сегменте) частично в крылья. Эти изменения были описаны как гомеозисные трансформации от греческого слова homeosis, означающего изменение одной структуры тела в др. Было установлено, что гомеозисные гены специфицируют качественные особенности сегментов тела мух вдоль передне-задней оси (1).

Нох гены предопределяют паттерны развития конечностей позвоночных. У кур, по крайней мере 23 Нох генов экспрессируются во время развития конечностей, с Ноха9 экспрессирующимся в проксимальной части конечности, из которой развиваются плечо или бедро. Ноха9, Ноха10 и Ноха11 экспрессируются в передних конечностях, где формируются radius и ulna ( или tibia и fibula). Ноха9-13 экспрессируются в запястье (или лодыжке) и пальцах. Сходный паттерн экспрессии обнаруживается для Hoxd генов, тогда как экспрессия кластера Нохс более сложная. Эти наблюдения иллюстрируют, что сложные сети экспрессии генов участвуют в развитии органов и указывают на функциональное перекрывание генов Нох, которое может маскировать эффекты пониженной экспрессии или мутаций индивидуальных Нох генов. Однако, ряд аномалий в конечностях людей описан и связан со специфическими Нох генами.

Synpolydactyly (SPD), редкое, доминантно наследуемое уродство конечностей с определенной комбинацией синдактилии (слияния пальцев) и полидактилии (добавочных пальцев), вызываемое мутациями в HOXD13. SPD обычно характеризуется синдактилией 3/4 пальцев he и 4/5 пальцев ног с удвоенным пальцем в синдактиличной складке. Затронутые члены семьи часто обнаруживают варьирующую экспрессию нарушения из-за неполной пенетрантности. Молекулярная основа SPD установлена при исследовании изолированной турецкой деревни (8). SPD локус был картирован на хромосоме 2q31, где расположен кластер генов HOXD (9). У нормальных индивидов экзон 1 HOXD13 содержит дефектную последовательность тринуклеотидных повторов, кодирующую полиаланиновый трек из 15 остатков, а каждая затронутая семья обнаруживала увеличение этого повтора, приводя к появлению дополнительных 7, 8 или 10 остатков (Рис. 3D)/

Brachydactyly, при которой наблюдается укаорочение пальцев, является редким проявлением у пациентов, которые гомозиготны по SPD (10). 2 пациента из 128, отобранных для хирургического восстановления врожденных аномалий конечностей, как было установлено имеют новую мутацию в HOXD13 гомеодомене (Ile314Leu). В дальнейшем специфические мутации в HOXD13 были сцеплены с разными комбинациями нарушений конечностей (11).

Hypodactyly, полу-доминантный синдром потери развития палаьцев, был изучен у мышей. Животные, гомозиготные по hypodactyly, обнаруживали выраженный дефицит образования пальцевых дуг, ассоциированый с делецией в экзоне 1 Hoxa13 (12). Это приводит к сдвигу рамки считывания, приводящего в результате к потере белка дикого типа Ноха13 и продукции нового, стабильного белка в зачатках конечностей мутантных мышей. Mortlock и Innis связали гиподактилию с очень сходным нарушением у людей - hand-foot-genital syndrome (HFGS), который отличается от SPD, т.к. деформации рук и ног полностью пенетрантны, билатерально симметричны и униформны по своей тяжести (13).

Первой HOXA13 мутацией, ассоциированной с HFGS была нонсенс мутация в экзоне 2, которая приводила к превращению остатка триптофана в гомеодомене в стоп кодон, к укорочению белка на 20 аминокислот (13). Некоторые пациенты с HFGS обнаруживают также экспансию полиаланинового трека HOXA13, сходную с таковой в HOXD13 при SPD (14, 15). Миссенс мутации в экзоне 2 ассоциировали с исключительно тяжелой формой HFGS (14). Два не родственных мальчика имели делеции в областях 1q24.1-q31 и 2q31.1-q32.2, которые включали HOXD3 и HOXD13, и имели тяжелые аномалии конечностей и гениталий (16). Др. пациенты, у который полностью кластер HOXD был делетирован, имели слабо выраженный фенотип SPD, указывающий на наследуемое перекрывание в сети НОХ генов.

HOX Genes and Lung Development

Развитие легких зависит от скоординированной экспрессии большого количества генов, тонко контролируемых во времени и в пространстве. Изучение экспрессии в легких плодов людей и грызунов продемонстрировало высокую экспрессию 3' Hox генов кластеров А и В (17, 18). Имеется заметное снижение экспрессии большинства из этих генов по ходу развития легких, указывающее на то, что они участвуют в ранних стадиях морфогенеза легких, таких как ветвление воздушных путей. Однако, некоторые Нох гены, напр., Ноха5, продолжают экспрессироваться на высоких уровнях в течение всего развития и могут быть необходимы для созревания легких (19).

Аномальная экспрессия НОХ генов ассоциирует с тяжелыми врожденными аномалиями легких, напр., HOXB5 избыточно экспрессируется как при bronchopulmonary sequestration (20), так и врожденной cystic adenomatoid malformation (18). Эти нарушения характеризуются разрегулированными паттернами морфогенеза в примордиальной легочной ткани. Сохраняющиеся высокие уровни экспрессии HOXB5 после ранних стадий развития легких приводят в результате к примитивной легочной морфологии. Измененные паттерны экспрессии НОХ генов продемонстрированы также при тяжелых приобретенных нарушениях, включая эмбфизему, первичную легочную гипертензию и легочные карциномы (21, 22).

Мышиные модели, в которых экспрессия Нох генов или снижена или делетирована, предоставляют строгие доказательства роли этих генов в структурном развитии респираторной системы и в регуляции продукции легочного сурфактанта. Степень морфогенеза ветвления снижается в результате уменьшения уровней Hoxb5 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (23). Более того, Ноха5 нокаутные мыши развиваются и рождаются в срок, но погибают в раннем неонатальном периоде из-за закупорки трахей, снижения экспрессии белков сурфактанта и легочной патологии, сходной с сурфактант-дефицитным респираторным distress синдромом у преждевременно рожденных новорожденных человека (24).

HOX Genes and Leukamia

Множественные НОХ гены кластеров А, В и С экспрессируются в гематопоэтических стволовых клетках. Негативная регуляция или множество НОХ генов появляются, когда клетки дифференцируются внутри данного клона. Напр., Care et al., продемонстрировали, что периферические Т лимфоциты, которые были стимулированы к пролиферации с помощью phytohaemagglutinin, обнаруживали быструю индукцию волны Нох генов от Hoxb1 до Hoxb9, т.е. в 3' → 5' направлении (25).

Пертурбации процесса клеточной дифференцировки с помощью реципрокных хромосомных транслокаций могут приводить к развитию лейкемии. Такие транслокации ведут к образованию слитых генов и могут вовлекать индивидуальные НОХ гены или регуляторы активности НОХ генов. Так, описаны транслокации t[7;11)(p15;p15) или t[(1;11)(q31;p15) при которых гены НОХА9 или HOXD13, соотв., слиты с NUP98 nucleoporin геном в редких случаях acute myeloid leukaemia (AML). Чаще перестройки mixed-lineage leukaemia (MLL1) гена, позитивного регулятора специфической экспрессии НОХ генов, обнаруживаются в ассоциации с AML у детей и взрослых. Оба типа транслокаций ведут к избыточной функции, затрагивая нормальный процесс дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток или детерминированных лимфоидных или миэлоидных предшественников путем неправильной регуляции паттернов экспрессии HOX генов.

Перестройки с участием MLL и его 39 генов партнеров идентифицированы, кстати, ассоциированными приблизительно у 5% пациентов, страдающих AML и у 22% пациентов с acute lymphoblastic leukaemia (ALL) (26). Чтобы исследовать транслокацию t[(1;11)(q31;p15), которая дает MLL-ENL слитый белок, обычно обнаруживаемый при острой лекемии у детей в миэлоидном и лимфоидном ростке, Horton et al., выявили регулируемую тетрациклином систему Mll-ENL экспрессию в первичных гематопоэтических клетках (27). Используя в реальном времени количественную PCR систему (28) они оказались способны измерять экспрессию всех 39 Нох генов мыши и показали, что снижение экспрессии генов Нох является специфическим для потери MLL-ENL и не является следствием дифференцировки. Они пришли к выводу, что система MLL-ENL необходима для инициации и поддержания иммортализации миэлоидных предшественников и может вносить влад в развитие лейкемии при аберрантной поддержке экспрессии "Hox code", состоящего из Hoxa1-Hoxa11.

HOX Genes and Cancer

Многочисленные исследования выявили функциональные взаимоотношения со злокачественным фенотипом (29). Некоторые исследователи проверяли постулат, что Нох гены экспрессируемые во время эмбриогенезе, но подавляемые во время взрослой жизни, повторно экспрессируются при неоплазии - т.наз. гипотезу "oncology recapitulates ontology". Во время эмбриогенеза существует тонкий баланс между пролиферацией и дифференцировкой клеток, который существенен для нормального развития плода. Напротив, при раке баланс между двумя процессами нарушен (30).