Материалы для хроматографии

В качестве материалов сорбентов используют вещества природного происхождения и синтетические – органические и неорганические полимеры.

Самые распространенные сорбенты - на основе целлюлозы, агарозы, окиси алюминия,

силикагели.

Химическая модификация сорбента - введение каких-либо функциональных групп. При этом можно получить сорбент с требуемыми свойствами, сродством к определенным классам соединений. Пример: силикагель можно легко модифицировать, получая частицы с заданным размером частиц, размером пор, разной удельной поверхностью и т.д.

Газовая хроматография

Применяется для определения состава лекарственных препаратов, примесей вредных веществ в воздухе, воде, почве, промышленных продуктах; а также в криминалистике и т.д. Позволяет разделить несколько см3 газа или мг жидких (твёрдых) веществ; время анализа от нескольких секунд до нескольких часов.

Для газо-адсорбционного варианта хроматографии в качестве сорбента (частицы диаметром 0,1-0,5 мм)используют силикагели, алюмогели, молекулярные сита, пористые полимеры и др. сорбенты с удельной поверхностью 5-500 м2/г.

Для газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) сорбент готовят нанесением жидкости в виде плёнки (высококипящие углеводороды, сложные эфиры, силоксаны и др.) толщиной несколько мкм на твёрдый

носитель с удельной поверхностью 0,5-5 м2/г и более.

Жидкостная хроматография ВЭЖХ

Используется для анализа, разделения и очистки синтетических полимеров, лекарственных препаратов, детергентов, белков, гормонов и др. биологически важных соединений. Использование высокочувствительных детекторов позволяет работать с очень малыми количествами веществ (10-11-10-9 г). Часто применяется молекулярно-ситовая хроматография и хроматография по сродству (основана на способности молекул биологических веществ избирательно связываться друг с другом).

Ионообменная хроматография

Широко распространенный вариант жидкостной хроматографии.

Используется в аналитических целях и для препаративного разделения веществ, позволяет отделять и разделять заряженные частицы - аминокислоты, белки, карбоновые кислоты. Основа метода – использование в качестве сорбента ионообменника – полимера, модифицированного

введением ионогенных групп. Если матрица имеет отрицательный заряд - катионо-обменник, положительный - анионообменник. Разделение основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника.

Катионо- и анионо-обменники бывают сильными и слабыми. Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервал. Ионизацией слабых

ионообменников можно управлять, меняя pH среды.

Гель-фильтрация

Позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений.

Основа метода - различная скорость диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами).

Сорбент - гель (мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами). Диффузия внутрь этих частиц лимитируется подвижностью молекул, которая зависит от их молекулярной массы. Мелкие молекулы легко проникают вовнутрь гранул геля и способны надолго задерживаться внутри гранул, а крупные - не проникают в гранулы и быстро выходят из колонки. Т.е. скорость продвижения мелких молекул будет

меньше скорости движения более тяжелых молекул

Сорбенты гель фильтрации

Полидекстрановые гели:

Сефадекс – гидрофильный гель, выпускается в сухом

виде, имеет маркировку G и номер, означающий пористость матрицы (количество воды в мл, которое

связывает 10 грамм сухого геля).

Сефакрил – поставляется в набухшем виде (густая

водная суспензия). Достоинства - более высокая (по сравнению с сефадексом) жесткость частиц (можно вести хроматографический процесс при больших

Сефароза – поставляется в виде суспензии. Гели её

довольно жесткие, но менее чем у сефакрила.

Аффинная хроматография

Позволяет разделять отдельные ферменты, белки, вирусы.

Основа метода - специфические взаимодействия частиц подвижной фазы с сорбентом.

Сорбент - гель типа агарозы, к которому

ковалентно привязаны подходящие лиганды (например, антитела или субстрат какого- либо фермента). При прохождении через сорбент подвижной фазы из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент (или антиген), который прочно связывается с сорбентом. Удаление фиксированного вещества - избытком растворителя.

Аффинная хроматография

Электрофорез

Процесс разделения заряженных частиц в электрическом поле. Явление электрофореза обнаружено Рейсом в 1809 г. Применение в клинико-диагностических лабораториях

– с 50-х г. XX в.

Теоретические основы (на примере белка): молекулы белка имеют положительно и отрицательно заряженные группы. Суммарный заряд молекул зависит от рН буфера, в котором растворен белок. При щелочном рН белки выступают как анионы, а в кислой среде - каккатионы (движутся, соответственно, к аноду или катоду). Каждый белок характеризуется определенным значением рН, при котором он не мигрирует, поскольку при этом значении сбалансированы противоположно заряженные группы - изоэлектрическая точка. Изменяя значения рН буфера можно производить разделение белков в электрическом поле.

Применение: разделение белков, липопротеинов, аминокислот (высоковольтный э/ф).

Носители, используемые для электрофореза

Среда-носитель может оказывать влияние на условия электрофореза, изменяя эффективность разделения, так как имеет собственный заряд (процесс электроэндосмоса).

В клинических лабораториях используют 2 типа носителей:

Ацетатцеллюлоза, агар, агароза. Это инертные материалы с порами больших размеров, которые не препятствуют миграции частиц. Степень электроэндосмоса разная, выбирают в соответствии с условиями проводимого разделения.

Крахмальные и акриламидные гели. Эти носители содержат поры, сравнимые по размерам с размерами белковых молекул, что обеспечивает комбинирование эффекта молекулярного сита с электрофоретическим разделением, основанным на распределении заряда. Электрофореграммы, нолученные на таких носителях

содержат больше фракций, чем на ацетатцеллюлозе, агаре и агарозе.