По типу носителя жидкой фазы

2. Принцип метода электрофореза

Электрофорез является единственно надежным способом обнаружения парапротеинов в биологических жидкостях, а также является уникальным методом скрининга. Благодаря данной методике возможно обнаружение изменений сывороточных белков, связанных с определенной патологией. Выявленные изменения по сравнению с нормальной структурой белка сыворотки, предупреждает врача о необходимости проведения дополнительного анализа белков.

Электрофорез на агарозном геле является наиболее распространенным методом. В настоящее время используется в клинической диагностики для обнаружения парапротеинов в сыворотке крови и моче. Клиническое использование электрофореза в анализе белков, как правило, базируется на простом и электрофоретическом разделении белков с учетом их относительной мобильности и молекулярной массой.

Правила забора материала: Сыворотку крови для исследования лучше брать свежей, хранившейся не более нескольких часов. В пробе не должно быть следов гемолиза; в противном случае свободный гемоглобин и его комплекс с гаптоглобином могут образовать дополнительные полосы в области a2- и b-глобулинов. В присутствии ионов кальция и под влиянием некоторых лекарственных веществ возможно расслоение b-фракции на две подфракции, что объясняется нарушением подвижности С3-компонента комплемента. Наконец, в целом качество «картинки» зависит от навыков нанесения пробы (это тоже определенное искусство, формирующееся практикой) и используемых инструментов-аппликаторов.

Необходим постоянный контроль рН буфера, применяемого для электродных камер и для смачивания пленок, т.к. от его значения зависит качество разделения фракций. Дело в том, что в ходе электрофореза на аноде и катоде протекают различные электрохимические процессы, приводящие к изменениям характеристик буферных растворов (в частности, рН). В связи с этим для восстановления его значения некоторые специалисты рекомендуют по окончании рабочего дня смешивать буферные растворы из разных электродных камер путем сливания в один сосуд, что позволяет существенно продлить срок службы буфера (в зависимости от интенсивности работы - до нескольких недель и более, но с условием периодического контроля рН; при выходе этого показателя за пределы ±0,1 0,2 от требуемых величин буферный раствор подлежит замене на свежеприготовленный). Срок работы электродных буферных растворов уточняется опытным путем; обычный признак потери их годности – сокращение длины разгонной дорожки, «наложение» белковых фракций друг на друга и «обрезанный» задний край гамма-глобулиновой фракции при обычных значениях тока (напряжения) и времени электрофореза. Замачивание пленок необходимо всегда осуществлять в свежем буферном растворе, не применявшемся в качестве электродного буфера.

Надо помнить, что электрофорез относится к полуколичественным исследованиям. Это определяется самой «технологией» его этапов, в частности, окраски проб и денситометрии.

По принятым международным правилам, первоначальная оценка результатов электрофоретического разделения сывороточных белков (выявление нормы или патологии) должна проводиться визуально. Проводится сравнение с картиной нормальной сыворотки, а количественные данные предназначены только для документирования результатов и динамического наблюдения. При оценке фракций только по процентному их содержанию возможны ошибки трактовки анализа. Например, при гипергаммаглобулинемии относительное количество альбумина (в %) автоматически окажется сниженным, хотя его абсолютная концентрация (в г/л) реально не изменялась. Для исключения недоразумений желательно количественно определять белковые фракции - в г/л, что легко осуществить умножением процентного содержания отдельных фракций на концентрацию общего белка в сыворотке крови. Можно дополнительно провести определение уровня сывороточного альбумина колориметрическим методом и результат сравнить со значением, полученным при электрофорезе; эта процедура одновременно поможет оценить качество анализа.

Анализ электрофореграмм:

Для выявления разделенных белков применяют разнообразные методы.

• Прямое исследование методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии (денситометрия)

• Осаждение неспецифическим агентом с последующим окрашиванием образца

• Специфические реакции фермент-субстрат, приводящие к образованию окрашенного нерастворимого продукта.

Осаждение макромолекул при помощи специфических антител. Образующийся нерастворимый преципитат исследуется либо прямым способом либо последующим окрашиванием красителем (иммуноэлектрофорез).

3. Иммуноэлектрофорез. Это двухэтапная процедура, при помощи которой макромолекулы (обычно белки) вначале разделяются с помощью электрофореза, а затем последовательно взаимодействуют с соответствующей антисывороткой, присутствующей в среде-носителе. Классический вариант – на 1 этапе производят разделение белков в забуференном агаровом или агарозном геле, а затем латерально, параллельно разделенным компонентам прорезают щели, которые заполняют антисывороткой. Выдерживают в течение некоторого времени для диффузии компонентов (обычно ночь). Взаимодействие антиген-антитело обнаруживается по дугам преципитации. Метод позволяет выявить антигенный состав сложной смеси белков и идентифицировать отдельные компоненты смеси с помощью моноспецифических антисывороток. В клинике используется для типирования парапротеинов сыворотки и выявления белков Бенс-Джонса.

Ракетный электрофорез (электроиммунодиффузия). Используют гель, содержащий АТ (как в иммунодиффузии). Вдоль кромки слоя геля делают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. Затем проводят ЭФ → в слое геля создается электрическое поле → АГ входят в гель. Они обычно движутся быстрее чем АТ и в одном направлении. Высота «ракеты», образующейся в ходе реакции прямо пропорциональна концентрации АГ, она измеряется от верхней границы лунки до высоты пика. Метод удобен, надежен и прост. Используется для определения альфа-фетопротеина в амниотической жидкости.

Капиллярный электрофорез. Используют заполненные электролитом (буфером) кварцевые капилляры с внутренним диаметром 25-200 мкм и длиной 10-100 см. К концам капилляров подается высокое напряжение – 10 000 – 30 000 в. Под действием напряжения возле стенок капилляра возникает отрицательное поле, в середине – положительное (за счет того, что кварц обладает положительно заряженными группами и под действием напряжения там происходит поляризация электролита). Под влиянием электростатического поля в капилляре создается электроосмотический поток, направленный к катоду. С ним к катоду перемещаются компоненты смеси различных веществ с различной скоростью → разделение → детекция (фотометр, флуориметр, рефрактометр и т.д._ Преимущества: очень высокая эффективность разделения (белков, пептидов, витаминов, лекарственных препаратов), не требует прецизионных устройств.