1. К общим показаниям для проведения клинико-генеалогического метода относятся:

• 1) наличие случая наследственного синдрома, а также с наследственной предрасположенностью в семье, прогрессирующее нарушение функций различных систем организма неясного генеза при исключении соматической патологии;

• 2) нарушение физического развития детей: неправильный рост, деформация костей туловища и конечностей, чрезмерное развитие подкожно-жировой клетчатки, тугоподвижность или гипермобильность в суставах, снижение зрения или слепота, тугоухость и глухота;

• 3) нарушение пигментации кожных покровов;

• 4) почечнокаменная болезнь у детей;

• 5) гемолитическая анемия, желтуха “эндогенного” генеза;

• 6) планирование потомства, возраст женщин, планирующих деторождение

моложе 18 или старше 35 лет;

• 7) первичная аменорея;

бесплодие у женщин и мужчин;

• 8) оценка мутагенных воздействий (в случае, если кто-либо из родителей имел контакт до или в период беременности с химическими, радиактивными и др. мутагенами);

• 9) первичное невынашивание беременности,

1 и более спонтанных абортов, выкидышей, мертворождения);

• 10) несовместимость родителей по резус-фактору;

• 11) кровное родство родителей;

• 12) накопление патологического признака в семье;

• 13) пренатальная диагностика наследственного синдрома

2. Основные генетические и клинико-параклинические характеристики хромосомных болезней:

• 1) 2 и более случаев спонтанных абортов или выкидышей, мертворождений в анамнезе, или рождение детей с пороками развития;

• 2) подозрение по клиническим проявлениям: начало врожденное, множественные микро- и макроаномалии у пробанда, особенно в сочетании с отставанием в психо-речевом и моторном развитии; задержка умственного и физического развития;

• 3) наличие иммунодефицита у таких детей, что проявляется склонностью к частым инфекциям и онкопатологии;

• 4) нарушение половой дифференцировки; недоразвитие вторичных половых признаков, задержка или преждевременное половое созревание, часто сочетающееся с умственной отсталостью или своеобразным психическим дефектом;

• 5) стационарное или медленнопрогрессирующее течение;

ограничена продолжительность жизни (в среднем до 30 лет), что обусловлено выраженностью пороков и/или иммунодефицита;

• 6) большинство случаев – спорадические (единичные), обусловленные спонтанными мутациями при формировании родительских гамет.

3. Основные генетические и клинико-параклинические характеристики наследственных болезней обмена веществ:

• 1) при большинстве форм имеет место аутосомно-рецессивный тип наследования (чаще встречаются кровно-родственные браки);

• 2) начало заболевания, как правило, в раннем детском возрасте; характерен "светлый промежуток" до первых клинических проявлений, т.е. когда состояние больного внешне не выявляет признаков болезни;

• 3) злокачественный, чаще всего, характер течения с высокой летальностью в детском возрасте;

• 4) полиорганность поражения;

• 5) неуклонно нарастающие психо-моторные расстройства, при исключении экзогенных причин болезни;

диффузная гипотония, гипорефлексия (реже - наоборот)

• 6) судорожный синдром;

• 7) патология органа зрения

(глазное дно: симптом "вишневой косточки",

атрофии дисков зрительных нервов, прогрессирующий офтальмопарез, птоз, как правило 2-х сторонний);

• 8) поражение внутренних органов: гепатоспленомегалия, цирроз, стойкая желтуха;

• 9) непереносимость отдельных пищевых продуктов, лекарственных препаратов, частая рвота, срыгивания, запоры, реже диарея (при отсутствии экзогенных причин), необычный цвет и запах мочи;

• 10) тугоподвижность или гипермобильность в суставах и др. прогрессирующие деформации опорно-двигательного аппарата (килевидная грудная клетка,"гаргоилизм", «ригидный позвоночник», вальгусная или варусная установка коленных суставов, «саблеобразные» конечности);

• 11) ацидоз, аминоацидурия;

• 12) аллергический дерматит;

• 13) специфические изменения при биохимическом исследовании активности ферментов и накопление аномальных субстратов в тканях и жидких средах организма (на основании тонкослойной хроматографии и др. методов);

• 14) чаще всего - резистентность к терапии;

4.Показания для периконцепционной профилактики

• 1. Повышенный риск мультифакториальных врожденных пороков развития, наследственной патологии.

• 2. Наличие хотя бы одного случая спонтанного аборта, выкидыша или мертворождения в анамнезе.

• 3. Наличие хронических заболеваний, сахарного диабета или других эндокринных, метаболических нарушений у кого-либо из родителей.

• 4. Рождение детей с гипотрофией, ВПР, неблагоприятно протекавшие предыдущие беременности, преждевременные роды в анамнезе.

• 5. Длительное употребление лекарственных и противозачаточных препаратов.

• 6. Контакт кого-либо из родителей до- или во время беременности (особенно до 12 недели) с мутагенными или тератогенными факторами.

• 7. Возраст родителей, планирующих деторождение, старше 35 и моложе 18 лет.

Цитогенетический анализ проводится с целью определения кариотипа, а также изучения структуры и функции хромосом, определения частоты сестринских хроматидных обменов, частоты и типов аббераций хромосом, исследования полового хроматина.

Объект цитогенетических исследований - делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Большинство цитогенетических исследований проводится на соматических клетках В цитогенетике применяются следующие методы: световая микроскопия, электронная и конфокальная лазерная микроскопия, люминисцентная микроскопия.

Материал: клетки слизистых оболочек, амниотической жидкости, ворсин хориона, плаценты, пуповинной крови, костного мозга.

• Наиболее удобным объектом для приготовления цитогенетических материалов является культура лимфоцитов периферической крови.

Показания для цитогенетического исследования

• 1) наличие случая хромосомного заболевания (ХЗ) в семье, либо подозрение на ХЗ по клиническим проявлениям: множественные микро- и макроаномалии у пробанда, особенно в сочетании с отставанием в психоречевом и моторном развитии; задержка умственного и физического развития и др.(см. тема №2) ;

• 2) первичное невынашивание беременности (2 и более спонтанных аборта, либо выкидыша, мертворождения), первичная аменорея, бесплодие у женщин и мужчин, что может быть обусловлено носительством сбалансированных хромосомных перестроек;

• 3) пренатальная диагностика хромосомной патологии;

• 4) синдромы с хромосомной нестабильностью (пр.: лейкоз, наследственные анемии, иммунодефицитные состояния);

• 5) оценка эффективности лечения, прогноза при лейкозах;

6) оценка мутагенных воздействий.

Исследование набора хромосом проводят используя различные методики рутинного окрашивания, при котором все хромосомы приобретают одинаковый цвет, равномерно распределенный по их длине. Такой метод позволяет определить количественные нарушения кариотипа, а также выявлять некоторые крупные внутри- и межхромосомные перестройки без уточнения их происхождения.

Поскольку метод рутинного окрашивания

малоинформативен,

основным методом анализа кариотипа остается

техника G – дифференциального окрашивания хромосом (G - бэндинг), которую разработал в конце 1960-х годов Torbjorn Caspersson.

В основе метода лежит выявление структурной дифференцировки хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования эухроматических и гетерохроматических районов (светлых и темных полос) по всей длине при окраске красителем Гимзы.

Темные полосы (G-полосы, G-бэнды) образуются в местах локализации гетерохроматина.

Этим способом можно идентифицировать хромосомы не только на стадии метафазы, но и в прометафазе, профазе, а также

плечи и даже определенные районы

(от 200 до 2000 участков),

выявлять делеции, инверсии, инсерции, транслокации, фрагильные сайты и более сложные перестройки.

Одной из характеристик хромосом является

асинхронность их репликации по длине.

Это свойство используется для дифференциальной окраски сестринских хроматид.

Этот метод позволяет легко выявлять обмены между сестринскими хроматидами, число которых увеличивается при

наследственных болезнях с хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, пигментная ксеродерма, лейкоз и др.) и при мутагенных воздействиях, что широко используется при изучении мутационного процесса у человека

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, основанных преимущественно на

флюоресцентной in situ гибридизации (FICH)

нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики.

Молекулярно-цитогенетические методы исследования:

• Интерфазная цитогенетика:

1.Многоцветный бэндинг хромосом (МВС).

2.Флуоресцентная in situ гибридизации (FISH).

3.Комбинация FISH с другими методами:

- цитология + FISH;

- гистология + FISH;

- имунофенотипирование +FISH (FICTION);

• Метафазная цитогенетика:

1.Сплошное окрашивание хромосом (Whole painting).

2.Сравнительная геномная гибридизация (CGH).

3.Кариотипирование с переменой цвета (CCK).

4.Многоцветное кариотипирование:

- спектральное кариотипирование (SKY);

- многоцветная FISH (M – FISH, M - BAND).

А. Интерфазная цитогенетика

позволяет проводить анализ хромосом на стадии интерфазы, когда они находятся в деспирализованном состоянии, что дает возможность объективно оценить процент клона клеток, несущих хромосомную абберацию.

Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) был разработан для выявления конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах.

В основе метода FISH лежит реакция гибридизации между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом

(олигонуклеотидная последовательность),

и комплементарным ему участком исследуемой денатурированной ядерной ДНК.

ДНК-зонд несет «метку», т.е. содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром.

На основе интерфазного FISH–анализа происходит интеграция цитогенетики с другими методами диагностики.

И в качестве исходного материала можно брать стандартно окрашенные мазки крови, костного мозга, архивный гистологический материал (парафиновые блоки).

Комбинация FISH с морфологическими методами позволяет сравнивать цитогенетические и морфологические особенности клеток.

Б. Метафазная цитогенетика.

- Метод сравнительной геномной гибридизации

(Comparative Genome Hybridization - CGH)

был создан для выявления количественных нарушений в геноме (геномные мутации).

Нормальную донорскую ДНК метят флуорохромами разного цвета.

После проведения FISH

метафазы анализируют на люминесцентном микроскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерного анализа изображения по всей длине каждой хромосомы.

Существуют различные варианты многоцветной FISH в цитогенетической диагностике:

- метод спектрального кариотипирования (SKY).

- M-FISH (multitarget, multifluor, multicolor или multiplex FISH) является общим названием традиционных многоцветных FISH.

- Метод многоцветного бэндинга хромосом (RxFISH)

позволяет выявлять часть внутрихромосомных перестроек, осуществляя анализ всего генома человека в одном эксперименте.

Таким образом , наиболее полный анализ кариотипа (определение нарушений набора хромосом, диагностика транслокаций, делеций, дупликаций, инверсий и инсерций)

можно провести, используя различные методы дифференциального окрашивания (G- и R-бэндинги), а также RxFISH и SKY в комбинации с DAPI, которые позволяют получить в конечном итоге поперечную исчерченность хромосом.

Методика FISH идеально подходит для детекции

конкретных хромосомных аберраций.

Для количественных изменений генетической информации можно использовать метод CGH

• 3. Диагностика возбудителей инфекционных заболеваний: вирусы гриппа, герпеса, цитомегаловируса, гепатита, ВИЧ, атипичной пневмонии, свиного гриппа, а также возбудителей токсоплазмоза, хламидиоза, иерсиниоза и других микроорганизмов, геном которых частично или полностью изучен.

• 4. Судебная медицина: диагностика спорного отцовства (материнства), идентификация личности.

• 5. Разработка методов этиотропного лечения НЗ и МФЗ: генотерапия, клеточная терапия (терапевтическое клонирование человека).

• 6. Тестирование генов системы детоксикации (персонализированная медицина).

• 7. Клонирование генов, секвенирование ДНК.

• 8. Индуцирование мутагенеза в эксперименте.

• 4. НА (Heteroduplex Analysis) —

гетеродуплексный анализ позволяет выявлять мутации, находящиеся в гетерозиготном

состоянии, а также инсерции и делеции.

• 5. Комбинация анализа гетеродуплексов и метода однонитевого конформационного полиморфизма позволяет выявить точковые мутации почти в 100% случаев.

• 6. ССМ (Chemical Cleavage of Mismatch) — метод химического расщепления неспаренных оснований можно применять для тестирования фрагментов ДНК размером до 1000 п.н..

Однако метод не нашел широкого распространения вследствие токсичности химических реагентов и методической сложности.

• 7. Метод секвенирования.

• Любые типы мутаций можно обнаружить путем прямого секвенирования мугантной кДНК или отдельных экзонов. Особенно удобным оказалось его применение для детекции мутаций в сравнительно небольших генах, таких, как ген фактора IX свертывания крови (гемофилия В).

Этапы ПЦР:

• 1. Выделение ДНК из материала: венозная кровь (1-2 мл.), клетки амниотической жидкости, ворсин хориона, пуповинной крови, плаценты, а также любой системы организма, содержащие ДНК, трупная ткань, костная ткань из мест захоронений.

• Для анализа достаточно 3-5 клеток.

Время выделения от 2-х до 24 часов.