Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

CREATION OF REAL–TIME PCR SYSTEMS FOR INVESTIGATION OFTHE PATHOLOGIA OFTHE IMMUNE SYSTEMAND THE ONCOLOGIC PROCESS

FilinaA.B., VlasovaA.V., Zubachova D.O., Svitich O.A.

I.Mechnikov Scientific Research Institute of Vaccines and Serums, Moscow, Russia 105064, Moscow, Small Kozenyi lane, 5

byzonka@yandex.ru

There were received the optimal conditions for RT-PCR to study the expression of chemokines and their receptors (CXCR12 and CXCR4) and polymorphic markers of the interleukins’ genes (IL-4 and IL-6).

Keywords: polymerase chain reaction in real time, chemoattractants, interleukins, polymorphic markers CXCLL12, CXCR4, IL-4, IL-6.

Introduction. There is required elaboration of RT-PCR systems to study immunopathological pathogenesis which allow to estimate the genetic sequence and expression of molecules of innate immunity, their receptors and regulatory RNAs that are involved in immunological reactions. The aim: To develop a system for RT-PCR to assess expression markers in genes of CCR4 and CXCL12, as well as genetic markers in genes IL-4 and IL-6. Materials and Methods: From the peripheral blood leukocytes of healthy donors were isolated DNA (K-SORB, Syntol, Russia) and from macrophage RNA (Ribo-Sorb, ILS, Russia). To determine the expression there were used sets “Reagents RT-1” and “Reagent kit for RT-PCR in the presence of the dye SYBR Green I» (Syntol, Russia). To determine the polymorphic markers there were used “Reagent kit for RT-PCR” (Syntol, Russia). RT-PCR were performed on a thermocycler PicoReal (Thermo Scientific). Results: As a result of this work were obtained the following data: the optimum temperature for RT-PCR system CXCL12 – 62°C, CCR4 – 60°C, the concentration of Mg2+ at the same time – 75 uM, IL-4 – 62°C, the concentration of Mg2+ – 75 uM ; IL-6 – 54°C 75μM and Mg2+, respectively. Conclusion: The elaborate system can be used to determine the expression and genetic markers associated with the violation of the cytokine network in pathological conditions of the immune system. It is planned to establish systems for the detection of regulatory RNAs that play a key role in the innate immune cells.

УДК 547.454

СИНТЕЗ ОЛИГОСАХАРИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ МИКОАНТИГЕНОВ ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГРИБКОВЫХ ПАТОГЕНОВ Карелин А.А., Орехова М.В., Комарова Б.С., Цветков Ю.Е., Аргунов Д.А., Крылов В.Б., Гербст А.Г., Дмитренок А.С., Нифантьев Н.Э.

Федеральное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН 119991, Москва, Ленинский проспект, 47

Факс. +7(499)-1358784 e-mail: nen@ioc.ac.ru

В рамках данной работы были синтезированы олигосахаридные фрагменты полисахаридов клеточной стенки опасных микопатогенов. Гликоконъюгаты на основе полученных соединений были использованы для генерации антител и изучения их специфичности. Полученные данные направлены на разработку востребованной вакцины и диагностикума тяжелого заболевания – аспергиллёза.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

Ключевыеслова:углеводныеантигены;полисахарид;антитела,вакцина,Aspergillusfumigatus. Опасный микопатогенA. fumigatus (чёрная гниль) вызывает у больных с ослабленным иммунитетомтяжелейшееипрактическинеизлечимоезаболевание –инвазивныйаспергиллёзлегких (ИАЛ). Критическим фактором для лечения ИАЛ является его своевременное обнаружение, что делает востребованным разработку чувствительного метода ранней диагностики, а также соз-

дание эффективного вакцинного препарата для превентивной терапии этого заболевания. Углеводные антигены, представленные на поверхности клеточной стенки этого гриба, игра-

ют важную роль в иммунологических процессах. В рамках данной работы были получены олигосахаридные фрагменты двух типов полисахаридов: галактоманнана и α-(1→3)-глюкана [1], а также гликоконъюгаты на их основе. Проведенные иммунологические исследования позволили получить поликлональные антитела, специфичные к полисахаридам данных типов. Полученные данные направлены на разработку вакцины и диагностикума против заболеваний,

вызываемых Aspergillusfumigatus.

Данная работа выполнена при поддержке гранта РНФ №14–23–00199 (НЭН).

[1] Komarova B.S., Orekhova M.V., Tsvetkov Y.E., Beau R., Aimanianda V., Latgé J.P., Nifantiev N.E.Synthesis of a Pentasaccharide and Neoglycoconjugates Related to Fungal α-(1→3)- Glucan and Their Use in the Generation of Antibodies to Trace Aspergillusfumigatus Cell Wall // Chem. Eur. J., 2015, Vol. 21. doi: 10.1002/chem.201404770.

THE SYNTHESIS OF OLIGOSACCHARIDE FRAGMENTS OF MYCOANTYGENES FOR THE IMMUNOLOGICALSTUDIES OF FUNGALPATHOGENES

KarelinA.A., Orekhova M.V., Komarova B.S., Tsvetkov Y.E.,Argunov D.A., Krylov V.B., GerbstA.G., DmitrenokA.S., Nifantiev N.E.

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences Leninsky prospect 47, 119991 Moscow

Fax.+7(499)-1358784 e-mail: nen@ioc.ac.ru

In the course of this work oligosaccharide fragments of cell wall polysaccharides from hazardous mycopathogenes were synthesized. Glycoconjugates based on the synthesized compounds were used to produce antibodies and to study their specificity. The obtained data are aimed towards the development of a highly demanded vaccine and a diagnostic system for the dangerous disease – aspergillosis.

Keywords: carbohydrate antigens; polysaccharide; antibody; vaccine; Aspergillusfumigatus.

The hazardous mycopathogenA. fumigatus is known to cause dangerous and practically incurable disease of invasive lung aspergillosis(ILA) in patients with low immunity. Its proper diagnosis is the critical factor for its treatment, which justifies the demands for the development of methods for early diagnostics and for finding of an effective vaccine to prevent the aspergillosis.

Carbohydrate antigens presented on the cell wall of these fungi play an important role in immu-

nological processes. In the course of this work oligosaccharide fragments of two types of polysaccha-

rides were synthesized: namely those of galactomannan and α-(1→3)-glucan [1] and corresponding

glycoconjugates. The immunological studies allowed production of polyclonal antibodies with spec-

ificity towards these polysaccharides. The obtained data are aimed towards the development of a

highly demanded vaccine and a diagnostic system for the diseases caused by Aspergillusfumigatus. This work was supported by the grant from Russian Scientific Foundation №14–23–00199 (NEN).

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

[1] Komarova B.S., Orekhova M.V., Tsvetkov Y.E., Beau R., Aimanianda V., Latgé J.P., Nifantiev N.E.Synthesis of a Pentasaccharide and Neoglycoconjugates Related to Fungal α-(1→3)- Glucan and Their Use in the Generation of Antibodies to Trace Aspergillusfumigatus Cell Wall // Chem. Eur. J., 2015, Vol. 21. doi: 10.1002/chem.201404770.

УДК578.74

ИММУНОБИОАДЪЮВАНТЫ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА ДЛЯ ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ Хасанова Л.М.1,2, Каширина О.С.2, Черникова М.И.2, Ильина А.В.1, Варламов В.П.1, Васильев Ю.М.2

1ФГБУН Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, Россия 117312, Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп.1

2ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия 105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а

e-mail: leysan.khasanova@gmail.com

Добавление адъювантов наоснове биополимера хитозана с различными физико-химиче- скими характеристиками (ФХХ) к инактивированным вакцинам против гриппа неодинаково повышает иммуногенность и защитный эффект в отношении гомологичного штамма A/ PuertoRico/8/1934 (H1N1). Иммунобиоадъюванты на основе хитозана могут стать основой для эффективных и безопасных вакцин против гриппа нового поколения.

Ключевые слова: вакцина, адъювант, грипп, хитозан

В настоящее время значительное вниманиев биомедицинских исследованиях уделяется природному катионному полисахариду хитозану. Хитозаны, полученные из различных источников (крабы, креветки, грибы и др.), могут отличаться по физико-химическим характеристикам (ФХХ), прежде всего степени дезацетилирования (СД)и молекулярной массе (ММ). Получены образцы хитозанов со следующими ММ и СД: 700 кДа, 85% (Х1) и 10 кДа, 85%(Х2), соот - ветственно. На модели инактивированной цельновирионной эмбриональной вакцины на основе штаммаA/PuertoRico/8/1934 (H1N1)изучены их адъювантные свойства. Добавление Х1 иХ2 к вакцине повышает титры антител против гомологичного штамма (иммуногенность)в 8 и 5 раз, соответственно (в сравнении с вакциной без адъюванта). Добавление Х1к вакцине в ряде случаев исключало репродукцию в легких дикого вируса после инфекции иммунизированных мышей (защитный эффект), тогда как добавлениеХ2 приводило к существенному снижению титров выделяемого из легких вируса в сравнении с контрольными группами. Таким образом, хитозаны с различными ФХХ проявляют неодинаковую адъювантную активность по иммуно- генности и защитному эффекту. Иммунобиоадъюванты на основе хитозана могут стать основой для эффективных и безопасных вакцин против гриппа нового поколения.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

UDC 578.74

СHITOSAN-BASED IMMUNOBIOADJUVANTS FOR NOVELVACCINESAGAINST INFLUENZA

Khasanova L.M1,2, Kashirina O.S.2, Chernikova M.I.2, Il’inaA.V.1, Varlamov V.P.1, Vasiliev Y.M.2

1Centre “Bioengineering”, Moscow, Russian Federation 117312, Moscow, 60-let. Oktyabrya av., 7, bld 1

2Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russian Federation 105064, Moscow, M.Kazeny l., 5а

e-mail: leysan.khasanova@gmail.com

Addition of adjuvants based on biopolymer chitosan with different physical-chemical characteristics (PCC) to inactivated vaccines against influenza increased immunogenicity and protective effect against the homologous A/PuertoRico/8/1934 (H1N1) strain in varying patterns. Chitosan-based immunobioadjuvants could become the platform for next generation effective and safe influenza vaccines.

Keywords: vaccine, adjuvant, influenza, chitosan

A natural cationic polysaccharide chitosan is currently being actively investigated in biomedical studies. Chitosans derived from various sources(crabs, shrimps, fungi etc.) may differ byphysical and chemical characteristics(PCC), especially deacetylation degree(DD) and molecular mass (MM). Сhitosan samples with the following MM and DD: 700 kDa, 85% (X1) and 10 kDa, 85% (X2), respectively, were produced, and their adjuvant properties were studied. An inactivated whole-virion embryonal vaccine based on the A/PuertoRico/8/1934 (H1N1) strain was used as a model. The addition of X1and X2 to the vaccine increased antibody titers against the homologous strain (immunogenicity) by 8 and 5 times, respectively (compared with the unadjuvanted vaccine). The addition of X1to the vaccine in several cases completely prevented reproduction of the wild-type strain in lungs of immunized mice (protective effect), whereas the addition of X2 resulted in a significant decrease of the- lung-isolated virus titers compared with control groups. Chitosans with different PCC show adjuvant activity by immunogenicity and protective effect in varying patterns, and chitosan-based immunobio-

adjuvants could become the platform for next generation effective and safe influenza vaccines.

УДК 547.454

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИГЕТЕРОГЛИКАНА ИЗ БАКТЕРИЙ

ENTEROCOCCUS

Крылов В.Б., Гербст А.Г., Дмитренок А.С., Шашков А.С., Нифантьев Н.Э

Федеральное бюджетное учреждение науки Институт органической химии им.

Н.Д. Зелинского РАН

119991, Москва, Ленинский проспект, 47

Факс. +7(499)-1358784 e-mail: nen@ioc.ac.ru

С использованием комплекса компьютерных и спектральных методов было установлено

строение нового углеводного антигена из бактерий рода Еnterococcus. Полученные данные о структуре полисахарида позволили осуществить направленный химический синтез его фраг-

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

ментов и изучить их иммунологические свойства, что создает теоретическую основу для раз - работки востребованного вакцинного препарата.

Ключевые слова: углеводные антигены; полисахарид; антитела, вакцина, конформационный анализ.

РодEnterococcusпредставляютсобойтретьюпозначимостигруппуграмположительныхбактерий, ответственных за госпитальную смертность в развитых странах. Отсутствие эффективной антимикробной терапии при бактериемии, вызванной различными штаммами Enterococcus, делает исключительно актуальным поиск антигенов, способных вызывать специфический иммунный ответ и блокировать возможное заражение крови этими бактериями. Недавно из бак - терии E. faecalis был выделен новый полисахаридный антиген – дигетерогликан, и показана перспективность его использования в качестве иммунологически активных компонентов вакцин и диагностикумов[1].

В рамках данной работы, с использованием химических, спектральных и компьютерных методов (конформационный анализ) были впервые установлены абсолютные конфигурации галактозного и лактильного остатков, входящих в состав дигетерогликана[2]. Это сделало возможным проведение направленного синтеза фрагментов данного полисахарида и исследование их взаимодействия с белками иммунной системы, в том числе с опсонизирующими антителами. Проведенное исследование создает необходимую теоретическую основу для создания востребованного антимикробного препарата.

Данная работа выполнена при поддержке гранта РНФ №14–23–00199 (НЭН).

[1]Theilacker C., Kaczyński Z., Kropec A., Sava I., Ye L., Bychowska A., HolstO., Huebner J. Serodiversity of opsonic antibodies against Enterococcus faecalis–glycans of the cell wall revisited// PLoSONE. 2011, Vol. 6.e17839.

[2]Krylov V.B., Gerbst A.G., Argunov D.A., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Kaczynski Z., Huebner J., Holst O., Nifantiev N.E.Definitive structural assessment of enterococcal-diheteroglycan

//Chem. Eur. J., 2015, Vol. 21.doi: 10.1002/chem.201405857.

STRUCTURALCHARACTERIZATION OFADIHETEROGLYCAN OF ЕNTEROCOCCUS

Krylov V.B., GerbstA.G., DmitrenokA.S., ShashkovA.S., Nifantiev N.E

N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences Leninsky prospect 47, 119991 Moscow

Fax. +7(499)-1358784 e-mail: nen@ioc.ac.ru

Using combination of computer assisted and spectral methods the structure of a new antigen from Enterococcus has been identified. The obtained data about this polysaccharide allowed to perform synthesis of its fragments and to study their immunological properties. Thus the theoretical basis for the development of a vaccine has been formed. Keywords: carbohydrate antigens; polysaccharide; antibody; vaccine; conformational analysis.

Bacteria of the gen Enterococcus form the third most important group of Gram-positive micro- organisms responsible for nosocomial mortality in the developed countries. Lack of the efficient an- timicrobial therapy against diseases caused by different strains of Enterococcus raises the need for search of antigens which would be able to provoke specific immune response and thus block possible sepsis. Recently a new polysaccharide antigentermed diheteroglycan was extracted from E. faecalis

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

and it was shown to be a promising subject to use as immunologically active component in vaccines and diagnostic systems [1].

In the present work a combination of chemical, spectral and computer assisted methods (conformational analysis) was employed to determine for the first time absolute configurations of galactose and lactic acid residues in the diheteroglycan.This made possible to synthesize fragments of this polysaccharide and to study their interactions with the immune system proteins including opsonizing antibodies. This study builds the necessary theoretical basis for the development of a highly demanded antimicrobial agent.

This work was supported by the grant from Russian Scientific Foundation №14–23–00199 (NEN).

[1]Theilacker C., Kaczyński Z., Kropec A., Sava I., Ye L., Bychowska A., HolstO., Huebner J. Serodiversity of opsonic antibodies against Enterococcus faecalis–glycans of the cell wall revisited// PLoSONE. 2011, Vol. 6.e17839.

[2]Krylov V.B., Gerbst A.G., Argunov D.A., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Kaczynski Z., Huebner J., Holst O., Nifantiev N.E.Definitive structural assessment of enterococcal-diheteroglycan

//Chem. Eur. J., 2015, Vol. 21.doi: 10.1002/chem.201405857.

УДК 577.2

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА CRM197 ДЛЯ СОЗДАНИЯ КОНЬЮГИРОВАННЫХ ВАКЦИН Лисицкая Л.А.1,2, Козырь А.В.1, Колесников А.В.1, Шемякин И.Г.1

1ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск,

Московская область, РФ, e-mail: lislidiya@gmail.com.

2Пущинский государственный естественно-научный институт РАН, Пущино, РФ.

Намибылиполучены синтетическийгенипродуцентCRM197,обеспечивающиепродукцию токсоида в количестве до 1 г с литра экспрессионной культуры без ферментации, и разработан метод очистки белка из нерастворимой фракции клеточного лизата, включающий этапы металлхелатной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографии и процедуры рефолдинга.

Ключевые слова: рекомбинантый белок CRM 197, конъюгированные вакцины.

Генетически инактивированный токсин Corynebacterium diphtheriae, содержащий аминокислотную замену G52E, (cross-reactive material 197, CRM197), широко применяется в качестве белкового носителя для получения конъюгированных вакцин, использующих полисахаридные антигены бактерий в качестве иммуногена. Для промышленного производства конъюгированных вакцин, необходим высокоэффективный продуцент рекомбинантного CRM197 в E. coli.

Кодирующая последовательность CRM197 дикого типа не обеспечивает эффективную продук-

цию белка ввиду использования редких для E. coli кодонов и общей нестабильности АТ-богатой

мРНК. Очистка рекомбинантного CRM197 сопряжена с необходимость рефолдинга белка из

тел включения, и удаления пирогенных примесей, связанных с белком. Для обеспечения эф-

фективной продукции и очистки CRM197 в E. coli, нами создана кодон-оптимизированная по-

следовательность токсоида, обеспечивающая высокий уровень экспрессии белка и разработана

методика очистки рекомбинантного продукта. Выход апирогенного очищенного CRM197 со-

ставляет до 300 мг/л бактериальной культуры с чистотой 98%, что в 4 раза выше, чем описано

ранее. Сконструированный продуцент и разработанная технология очистки CRM197 будут ис- пользованы для создания конъюгированной брюшнотифозной вакцины нового поколения.

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России в рамках Соглашения о субсидии от 27 июня 2014 года №14.604.21.0067.

UDC 577.2

EFIICIENT PRODUCTION, REFOLDING,AND PURIFICATION OF CODON-OPTIMIZED SOLUBLE RECOMBINANT CRM197SUITABLEAS CARRIER PROTEIN FOR GLYCOCONJUGATE VACCINES

Lisitskaya L.A.1,2, KozyrA.V.1, KolesnikovA.V.1, Shemyakin I.G.1.

1Federal State Institution of Science State research center for applied microbiology & biotechnology, Obolensk, Moscow region, Russia.

2Pushchino State Natural Science Institute of the Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia. e-mail: lislidiya@gmail.com.

We obtained a synthetic gene and CRM197 producer, which provide toxoid production in an amount of 1 g per liter of the expression culture without fermentation. Protein purification technique from the insoluble fraction of the cell lysate was developed, it comprises the steps of metal chelate, anion exchange and gel filtration chromatography and refolding procedures.

Keywords: recombinant protein CRM 197, conjugate vaccine.

Genetically inactivated toxin of Corynebacterium diphtheriae, containing amino acid substitution G52E (cross-reactive material 197, CRM197) is widely used as protein carrier for synthesis of glycoconjugate vaccines, exploiting immunogenic properties of bacterial polysaccharide antigens. Industrial-scale production of conjugate vaccines requires development of E. coli strain producing gram/l quantities of recombinant CRM197 under fed-batch conditions.Wild-type coding sequence for CRM197is unsuitablefor overproductiondueto presenceof codons rarelyusedin E. coli,and instability of AT-rich mRNA. Production and purification of CRM197 in E. coli necessitates refolding of the protein from inclusion bodies and pyrogen removal. We have therefore designed codon-optimized toxoid sequence, which provides a high level protein expression, and developed purification and refolding scheme yieldingupto 300mgof 98%pure soluble apyrogenicCRM197per literof shake flask bacterial culture. Thus, about 4 times higher yield of recombinant CRM197 was achieved comparing to the previous data. Resulting E. coli strain overproducing CRM197 will be used for large-scale production of protein carrier enhancing immunogenicity of new conjugate polysaccharide typhoid vaccine.

This work was financially supported by the state on behalf of the Ministry of education and science of the Russian Federation according to the Agreement on subsidies from June 27, 2014 №

14.604.21.0067.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

УДК 577.112.083, 577.352.335

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩЕГО БЕЛКА УКРОПА Мельникова Д.Н., Минеев К.С., Рычкова М.Е., Финкина Е.И., Богданов И.В., Арсеньев А.С., Овчинникова Т.В.

Федеральное агентство научных организаций (ФАНО России) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), Москва, Россия 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

e-mail: d_n_m_@mail.ru

Разработан биотехнологический способ получения рекомбинантного липид-транспортиру- ющего белка укропа (Ag-LTP) и его 13C,15N-меченого аналога. Установлена пространственная структура Ag-LTP. Показана способность Ag-LTP ингибировать рост фитопатогенных грибов и связывать широкий спектр липидных молекул, включая жирные кислоты и жасмоновую кисло - ту. Продемонстрировано иммунологическое сходство Ag-LTP укропа с аллергенными LTP.

Ключевые слова: липид-транспортирующий белок; укроп; гетерологичная экспрессия; перекрестно реагирующие аллергены

К классу липид-транспортирующих белков (LTP) относится широкий спектр растительных аллергенов. Они являются пищевыми аллергенами фруктов, орехов, овощей и участвуют в развитии аллергических реакций на пыльцу и латекс. Достаточно высокая структурная гомология LTP делает их перекрестно реагирующими аллергенами. Исследование структуры и аллергенных свойств липид-транспортирующих белков растений и выявление аминокислотных остатков, входящих в состав их линейных и конформационных эпитопов, является необходимым этапом на пути создания новых диагностических тест-систем и аллерговакцин.

Из зеленых частей укропа огородного Anethum graveolens L. нами был выделен новый ли- пид-транспортирующий белок, названный Ag-LTP. Были установлены его полная аминокислотная последовательность и структура кДНК. Для исследования структурно-функциональных и иммунологических свойств липид-транспортирующего белка укропа был разработан биотехнологический способ получения рекомбинантного Ag-LTP и его 13C,15N-меченого аналога. Экспрессия Ag-LTP и его меченного стабильными изотопами аналога осуществлялась в клетках штамма E. coli BL21(DE3), культивируемых в LB или на бедной среде, содержащей [15N]- аммонияхлориди[13C]-D-глюкозув качествеединственныхисточниковатомовазотаиуглерода, соответственно. Целевые рекомбинантные белки были получены с использованием аффинной

хроматографии, реакции расщепления гибридных белков бромцианом и ОФ-ВЭЖХ.

Пространственная структура липид-транспортирующего белка укропа Ag-LTP в во-

дном растворе была определена методом ЯМР-спектроскопии. Было показано, что структу-

ра Ag-LTP представлена четырьмя α-спиралями и содержит длинную неупорядоченную петлю

в С-концевом участке молекулы. Неполярные аминокислотные остатки Ag-LTP формируют ха-

рактерную для растительных LTPгидрофобную полость, являющуюся потенциальным центром

связывания липидов.

Исследование антимикробной активности рекомбинантного Ag-LTP показало, что белок

активен в отношении фитопатогенных грибов, но не влияет на рост бактериальных культур.

Исследование способности рекомбинантного Ag-LTP связывать липидные молекулы выявило, что белок с приблизительно одинаковой эффективностью связывает предельные и непредель-

156 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

ные жирные кислоты с различной длиной углеводородной цепи, а также жасмоновую кислоту – растительный гормон, участвующий в регуляции роста растения.

Иммунологические свойства Ag-LTP укропа были исследованы с помощью методов иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа при использовании поликлональных кроличьих антител к аллергену чечевицы Len c 3, принадлежащего к классу LTP. Результаты проведенного исследования выявили способность антител к Len c 3 связываться с Ag-LTPукропа и свидетельствовали о сходстве структурной организации и иммунологических свойств двух LTP.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (соглашение № 14-50-00131).

U.D.C. 577.112.083, 577.352.335

INVESTIGATION OF STRUCTURAL, FUNCTIONAL,AND IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OFTHE DILLLIPID TRANSFER PROTEIN

Melnikova D.N., Mineev K.S., Rychkova M.E., Finkina E.I., Bogdanov I.V.,ArsenievA.S., Ovchinnikova T.V.

M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

117997, Moscow, Miklukho-Maklaya str., 16/10, e-mail: d_n_m_@mail.ru

A biotechnological method for production of the recombinant lipid transfer protein from the dill Anethum graveolens L. (Ag-LTP) and its 13C,15N-labeled analog was developed. The spatial structure of Ag-LTP was determined by heteronuclear NMR spectroscopy in aqueous solution. It was shown that theAg-LTPwas able to inhibit growth of phytopathogenic fungi and to bind a wide range of lipid molecules including fatty acids and jasmonic acid. It was found that immunological properties of AgLTP were similar to those of other allergenic LTP.

Keywords: lipid transfer protein; dill; heterologous expression; cross-reacting allergens

Many plant lipid transfer proteins (LTP) are allergens. They are involved in the development of allergic reactions to fruits, nuts, vegetables, pollen, and latex. High structural homology of LTP makes them cross-reactive allergens. Investigation of structure and allergenic properties and identification of amino acid residues which compose their linear and conformational epitopes is a necessary step towards the development of new diagnostic test systems and allergy vaccine.

A novel plant LTP, termed Ag-LTP, was isolated from leaves and stalks of the garden dill Anethum graveolens L. The complete amino acid sequence and cDNA structure of Ag-LTP were determined.

In order to determine tertiary structure and functional activity of the dill lipid transfer protein the recombinant Ag-LTP and its 13C,15N-labeled analog were obtained. Ag-LTP and its labeled analog were expressed in E. coli strain BL21(DE3). The cells were grown in LB or in a minimal medium, containing 15N-labeled ammonium chloride and [U-13C6]-labeled glucose as the only nitrogen and carbon sources, respectively. Downstream process of the recombinant proteins purification involved immobilized metal-chelate affinity chromatography (IMAC), CNBr cleavage of the fusion protein and reversed-phase HPLC.

The spatial structure of Ag-LTP was determined by heteronuclear NMR spectroscopy in aqueous solution. The polypeptide chain of Ag-LTP forms four α-helices and a long random coil C-terminal tail. Nonpolar amino acid residues form a hydrophobic cavity typically occurring in plant LTP. This cavity contains a potential binding site of lipids.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

It was shown that recombinant Ag-LTP possessed an antimicrobial activity against phytopathogenic fungi, but did not affect the bacterial growth. Study of the ability of the recombinant Ag-LTP to bind lipid molecules revealed that the protein could associate both with saturated and unsaturated fatty acids of different chain length, as well as jasmonic acid – a plant hormone involved in plant growth regulation.

Immunological studies of the dill Ag-LTP were carried out by immunoblotting and ELISA with the use of polyclonal rabbit antibodies against lentil Len c 3 allergen belonging to the LTP family.An ability of the antibodies against Len c 3 to bind the dill Ag-LTP revealed similarity of the structural organization and immunological properties of both LTP.

The work is supported by the Russian Science Foundation (the agreement No. 14-50-00131).

УДК 602.68:57.083+557.175.324

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИРЕОТРОПНОГО ГОРМОНА ЧЕЛОВЕКА Порываева В.А., Агафонова О.А., Марченко А.К., Соболева Н.В., Сорокина Н.Н., Вторушина И.А., Рукавишников М.Ю.

ЗАО «Вектор-Бест», п. Кольцово Новосибирской области, Россия 630559  Новосибирская обл., п. Кольцово, а/я 121

E. mail: poryvaeva@vector-best.ru

Созданаиохарактеризованапанельмышиныхмоноклональныхантител(МоАт)к тиреотропномугормонучеловека(ТТГ).ВыделеныгруппыМоАтк β-субъединицеТТГик α-субъединице, общей для всех пептидных гормонов. Показана возможность построения «сэндвич»-варианта ИФА для выявления ТТГ с использованием МоАТ из нашей панели.

Ключевые слова: моноклональные антитела, тиреотропный гормон, диагностика.

Целью работы являлось разработка диагностических моноклональных антител (МоАТ) к тиреотропному гормону человека (ТТГ). Для иммунизации мышей линии BALB/c и скри - нинга позитивных гибридом использовали очищенный природный ТТГ производства LeeBio. Полученную нами коллекцию гибридомных антител для уточнения специфичности исследовали на реактивность с 3-мя другими пептидными гормонами: лютеинизирующим гормоном (ЛГ), фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) и хорионическим гонадотропным гормоном (ХГЧ) – и разделили на 2 группы. АТ первой группы реагировали только с ТТГ, но не с ЛГ, ФСГ и ХГЧ, что позволило заключить, что они специфичны к β-субъединице ТТГ. Ко второй группе отнесли АТ, которые реагировали со всеми пептидными гормонами и, следовательно,

связывались с α-субъединицей, общей для всех 4-х пептидных гормонов. Критериями отбора

для дальнейшей работы была специфичность антител к β-субъединице ТТГ с высоким индек-

сом аффинности. Соответствующие гибридомы клонировали методом лимитирующих разве-

дений и моноклональные антитела исследовали в качестве компонентов «сэндвич»-варианта

ИФА для определения ТТГ. Методом конкурентного ИФА мы показали наличие 4-х непере -

крывающихся антигенных детерминант (АГД) на β-субъединице ТТГ и 2-х – на α-субъединице.

Мы обозначили их АГД-α (1-2) и АГД-β-ТТГ (1-4). Нами выявлено, что АГД-α-1 и АГД-β-ТТГ-1

расположения на молекуле ТТГ в непосредственной близости. Это следовало из того, что МКА,

реагирующие с АГД- α-1 и МКА, специфичные к АГД β-ТТГ-1, конкурировали между собой за

связывание с ТТГ. По такому же критерию установили близость расположения на молекуле ТТГ АГД-α-2 и АГД-β-ТТГ-2. Наличие МоАТ к разным неперекрывающимся АГД на молекуле ТТГ