Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

УДК 615.275.4

THERAPY SECONDARY IMMUNODEFICIENCY RECOMBINANT PROTEIN, CONTAINING IN ITS COMPOSITION SEQUENCE MYELOPEPTIDES

MartynovA.I., Stepanenko R.N., Gasanov V.A., ChevalierA.F., Novikova E.M.Kozyreva O.V., Petrov R.V.

National Research Center – Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia 115478, Moscow, Kashirskoye, 24, k2

e’mail: immune48@mail.ru

Developed a recombinant protein comprising in its composition sequence of myelopeptides capable of hydrolysis in the human body at predetermined sites to release these myelopeptides

Keywords: Myelopeptide, hydrolysis, protease, recombinant protein

Recombinant protein based on alternating myelopeptides MP-1 (FLGFPT), MP-2 (LVVYPW), MP-3 (LVCYPQ) and MP-4 (FRPRMTP), interspersed specific protease recognition sites that are included in one molecule, is capable of hydrolyzing in the human body, with the release of data myelopeptides. Fused structure with proteases recognition sites simulates the natural situation, when the peptides are the products of hydrolysis of protein proteinase, which allows gradually release the active peptides in quantities sufficient for the biological effect of each component, without overdosing.

Comparison with a preparation of recombinant protein Miyelopid main pharmacological active ingredient are myelopeptides, a key factor for – activating antibody demonstrated that the recombinant protein 3-fold more effective. It is established that under the influence of protein synthesized in the lymph nodes draining the site of antigen administration increases the relative amount of lymphocytes.

At present, on the basis of the synthesized recombinant protein developed a medicine for the treatment of secondary immunodeficiency states.

ЭНДОГЕННЫЕ АЛАРМИНЫ КАК ИСТОЧНИК НОВЫХ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Пинегин Б.В., Пащенков М.В.Жмак М.Н1., Мартынов А.И.

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный Научный Центр – Институт иммунологии» Федерального Медико-Биологического Агентства России, Москва, Россия.

115478, Москва. Каширское шоссе. д. 24. кор. 2. bvpinegin@yandex.ru

1Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук. Москва. Россия.

117437.  Москва. ул. Миклухо-Маклая. д. 16/10.

Ключевые слова: врождённый иммунитет, алармины, комплекс ДНК/пептид LL-37, NK- клетки, цитокины.

Врождённая иммунная система является первой линией защиты организма от различных факторов как экзогенной, так и эндогенной природы. К экзогенным факторам относятся веще- ства микробной природы, к эндогенным факторам относятся вещества, синтезирующиеся или выделяющиеся из клеток организма под влиянием различных активаторов и повреждающих

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

агентов. Эти факторы получили название сигналов тревоги или аларминов. К сигналам тревоги, в частности, относится ДНК, которая является мощным активатором всех клеток врождённого иммунитета. Но в норме эта ДНК мгновенно разрушается ДНКазой-I. Но при взаимодействии с катионным пептидом LL-37, присутствующим в норме в биологических жидкостях, приобретает устойчивость к нуклеазам и способность проникать практически во все клетки организма. Нами показано, что комплекс ДНК/пептид LL-37 является мощным активатором клеток врождённого иммунитета. Этот комплекс повышает цитотоксическую активность NK-клеток, индуцирует в моноцитах синтез ИФН типа I, в нейтрофилах – синтез цитокинов ИЛ-8 и ИЛ17. Мы считаем, что комплекс ДНК/пептид LL-37 является кандидатом для создания нового эффективного иммуностимулирующего лекарственного средства для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостаточность иммунной системы, в частности для лечения онкологических заболеваний.

ENDOGENOUSALARMINSASASOURCE OF NOVELIMMUNOSTIMULATORY DRUGS Pinegin B.V., Pashenkov M.V., Zhmak M.N., MartinovA.I.

National Research Center. Institute of immunology. Federal Medico-Biological Agency. Moscow. Russia. 24-2 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia

Keywords: innate immunity, alarmin, complex of DNA/LL-37, NK-cells, cytokines.

The innate immune system is a first line of defence of the organism against diverse exogenous and endogenous factors. The exogenous factors include substances of microbial origin, the endogenous ones include substances that are synthesized and/or released from activated or damaged cells of the organism. These factors are termed ‘danger signals’or ‘alarmins’. One of the danger signals is DNA, which is a potent activator of all cells of the innate immunity. In its ‘naked’ form, DNA is quickly destroyed by DNase I. However, when DNA is bound to a cationic peptide LL37, which is normally present in biological fluids, it becomes resistant to nucleases and, moreover, acquires a capability to penetrate virtually all cells of the body. We have shown that the DNA-LL37 complex is a potent activator of innate immune cells. The complex augments cytotoxic activity of NK cells, induces the production of type I interferons in monocytes and of IL-8 and IL-17 in neutrophils. We consider this complex as a candidate immunostimulatory drug to treat and prevent diseases associated with immune deficiencies, in particular oncological diseases.

ПОЛИМУРАМИЛ – НОВЫЙ ИММУНОСТИМУЛЯТОР МУРАМИЛПЕПТИДНОЙ ПРИРОДЫ Пинегин Б.В., Пащенков М.В., Львов В.Л., Мартынов А.И.

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный Научный Центр –

Институт иммунологии» Федерального Медико-Биологического Агентства, Москва, Россия

115478, Москва, Каширское шоссе. д.24. кор.2. mvpashenkov@yandex.ru

Получен новый иммуностимулятор Полимурамил, представляющий собой смесь мурамил-

пептидов грамотрицательных бактерий. Показаны возможности применения препарата как ак-

тиватора врожденного иммунитета для лечения и профилактики бактериальных и вирусных инфекций.

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Ключевые слова: врождённый иммунитет, мурамилпептиды, NOD1, NOD2, бактериальные инфекции, вирусные инфекции.

Стимуляция системы врожденного иммунитета с помощью веществ микробного происхождения является перспективным способом профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека. Получен новый мурамилпептидный иммуностимулятор – Полимурамил, который представляет собой смесь трех мурамилпептидов грамотрицательных бактерий: 1) N-ацетил- D-глюкозаминил-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D-изоглютамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты (ГМтри), 2) N-ацетил-D-глюкозаминил-N-ацетил-D-мурамоил-L-аланил-D- изоглютамил-мезо-диаминопимелоил-D-аланина (ГМтетра) и 3) димера ГМтетра (диГМтетра). Компоненты Полимурамила активируют клетки врожденного иммунитета через рецепторы NOD1 и NOD2. Полимурамил индуцирует синтез провоспалительных цитокинов макрофагами и дендритными клетками человека; при введении мышам активирует компоненты антибактериальной защиты и резко повышает резистентность к летальной дозе St. aureus. По данным клинических испытаний, препарат достоверно улучшает результаты лечения гнойных инфекций. Кроме того, в доклинических исследованиях показано, что Полимурамил может быть эффективен и при профилактике вирусных инфекций. Таким образом, Полимурамил является иммуно - стимулятором противобактериальной и противовирусной направленности.

POLYMYRAMYL:ANEW MUROPEPTIDE IMMUNOSTIMULANT Pinegin B.V., Pashenkov M.V., Lvov V.L., MartynovA.I.

Federal State Budget Institution “National Research Center Institute of Immunology” of the Federal Medical-Biological Agency, Moscow, Russia

Kashirskoe shosse 24, bldg 2, 115478 Moscow, Russia. mvpashenkov@yandex.ru

We describe a new immunostimulant, Polymuramyl, which represents a cocktail of muropeptides from gram-negative bacteria. We show the possibilities to use this drug to activate innate immunity in order to treat and prevent bacterial and viral infections.

Keywords: innate immunity, muropeptides, NOD1, NOD2, bacterial infections, viral infections.

Stimulationof theinnateimmunesystemusingmicrobialcompoundsisa promisingapproachto the treatmentand prevention of humaninfectiousdiseases.Polymuramylisa newimmunostimulatorydrug derived from gram-negative peptidoglycan. The drug represents a mixture of three muropeptides: (1) N-acetyl-D-glucosaminyl-N-acetyl-D-muramoyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-meso-diaminopimelic acid (GMtri); (2) N-acetyl-D-glucosaminyl-N-acetyl-D-muramoyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-meso- diaminopimeloyl-D-alanin (GMtetra); and (3) a dimer of GMtetra (diGMtetra). The components of Polymuramyl activate innate immune cells via NOD1 and NOD2 receptors. Polymuramyl induces the production of pro-inflammatory cytokines by human macrophages and dendritic cells; when ad- ministered to mice, it activates anti-bacterial defence mechanisms and strongly increases resistance to the lethal dose of St. aureus. Clinical trials have shown that the drug significantly improves treat- ment outcome in purulent infections. Besides, pre-clinical studies indicate that Polymuramyl may also be useful in prevention of viral infections, such as influenza. In all, Polymuramyl is an immunostimu- lant directed against bacterial and viral infections.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

УДК 615.2; 616.98

ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ Петров А.В., Ищенко А.М., Александров Г.В., Симбирцев А.С.

ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России, С-Петербург, Россия 197110, С-Петербург, ул. Пудожская 7

e-mail: avpetrov@hpb-spb.com

Рекомбинантный интерлейкин-7 человека получен биотехнологическим путем из супернтатанта штамма-продуцента на основе клеток СНО. Изучены физико-химические характеристики белка и его активность, создана лекарственная форма. На животных показано, что препарат стимулирует лимфопоэз в норме и в моделях лимфопении.

Ключевые слова: цитокин, интерлейкин-7, гликопротеин, лимфопения, иммунодефициты

Интерлейкин (ИЛ)-7 – цитокин, стимулирующий лимфопоэз и гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов. В качестве лекарственного препарата ИЛ-7 может быть перспективен для лечения различных, прежде всего, Т-клеточных иммунодефицитов, включая CD4-лимфопению у пациентов с ВИЧ-инфекцией, лимфопению после лучевой, химиотерапии и трансплантации костного мозга, а также возрастных иммунодефицитов.

РазработанатехнологияполучениясубстанциирекомбинантногоИЛ-7человека,основанная на культивировании штамма-продуцента на основе клеток СНО в биореакторе и последующей хроматографической очистке целевого белка. Создана лекарственная форма в виде раствора для подкожного введения, разработаны методы контроля качества.

Полученный белок является обильно гликозилированным гликопротеином, стимулирует пролиферацию лимфоцитов in vitro. При курсовом введении интактным животным препарат вызывает дозозависимое увеличение количества лимфоцитов периферической крови, клеточности селезенки, расширение лимфоидного ростка в красном костном мозге, а в моделях лимфопении ускоряет восстановление числа лимфоцитов в периферической крови и лимфоидных органах. При исследовании фармакокинетики препарата на животных установлено, что биодоступность при подкожном введении составляет около 50%, время полувыведения – 6-10 часов. В настоящее время продолжается исследование токсичности разработанного препарата.

PRECLINICALSTUDY OF DRUG BASED ON RECOMBINANT INTERLEUKIN-7 FOR TREATMENT OF SECONDARY IMMUNE DEFICIENCIES

PetrovA.V., IschenkoA.M.,Alexandrov G.V., SimbirtsevA.S.

FGUP «State Research Institure of Highly Pure Biopreparations»

FMBA of Russia, St-Petersburg, Russia

7  Pudozhskaya str. St-Petersburg, 197110 e-mail: avpetrov@hpb-spb.com

Recombinant interleukin-7 was manufactured using biotechnological methods from the superna-

tant of CHO producer cell line. Physico-shemical properties and biological activity of the protein was

studied, drug formulation was developed. In animal studies the drug was shown to stimulate lympho-

poiesis in healthy and lymphopenic mice.

Keywords: cytokine, interleukin-7, glycoprotein, lymphopenia, immune deficiency

142 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Interleukin (IL)-7 is a cytokine that stimulates lymphopoiesis and homeostatic proliferation of lymphocytes. IL-7 is a promising drug for treatment of various, mainly T-cell immune deficiencies, including CD4-lymphopenia in HIV-infected patients, lymphopenia induced by radio-, chemotherapy or bone marrow transplantation, and age-related lymphopenia.

We developed technology for production of human recombinant IL-7 active substance based on cultivation of CHO producer cell line in a bioreactor and subsequent chromatografic purification of the target protein. Drug formulation as a solution for subcutaneous injection was developed as well as methods for quality control.

The IL-7 protein that we obtained is a highly glycosylated glycoprotein that stimulates proliferation of lymphocytes in vitro. After daily administration to intact mice a dose-dependent increase of peripheral blood lymphocytes counts, spleen cellularity and expansion of lymphocyte precursors in bone marrow was observed. In models of lymphopenia the drug increases recovery of lymphocytes in peripheral blood and lymphoid organs. Pharmacokinetic study in animals showed that bioavailability after subcutaneous administration is 50% with half-life about 6-10 hours. Toxicity studies of developed drug are under way.

УДК 571.27

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ Т-ЛИМФОЦИТОВ Сенников С.В., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Облеухова И.А., Лопатникова Ю.А.

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д.14

e-mail: sennikov_sv@mail.ru

Разработан протокол получения чистых популяций цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухолевого белка HER2/neu. Показан высокий уровень цитотоксического эффекта полученных клеток в отношении клеточной линии MCF-7, по сравнению с общей фракцией активированных мононуклеаров.

Ключевые слова: цитотоксические Т-лимфоциты, антигенспецифические клетки, дендритные клетки, HER2/neu, стимуляция противоопухолевого иммунного ответа

Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) считаются основными агентами в реализации противоопухолевого клеточного иммунитета. В современной иммунотерапииопухолевых заболеваний активно применяются подходы, основанные на презентации антигенов ЦТЛ дендритными клетками (ДК).Технология стрептамеров позволяет выделять антигенспецифические ЦТЛ с последующим эффективным удалением реагентов окрашивания, не влияя при этом на их жизнеспособностьифункции.Цельюданнойработысталополучениепопуляцийантигенспеци- фических ЦТЛ и оценка их цитотоксического эффекта по отношению к опухолевой линии MCF- 7.Объектом исследования являются мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК) условно здоровых доноров, позитивных по генотипу HLAA*02. В работе использованы методы культуральной работы с МНК ПК, магнитной трансфекции ДК, проточной цитометрии, окра- шивания стрептамерами и магнитной сортировки HER2-специфических Т-клеток.В результате работы разработан протокол получения популяций HER2-специфичных ЦТЛ. Анализ цитоток- сичности HER2-специфических Т-клеток показал высокий уровень цитотоксического эффекта в отношении клеточной линии MCF-7, по сравнению с цитотоксичностью общей фракции ак-

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

тивированных МНК (49,3% поврежденных опухолевых клеток против 22,3%). Таким образом, показано, что выделенная популяция HER2-специфических Т-лимфоцитов представляет собой популяцию клеток-эффекторов, способных эффективно элиминировать опухолевые клетки.

DEVELOPMENT OFTECHNOLOGY FOROBTAININGANTIGEN-SPECIFIC CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES

Sennikov S.V., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Obleukhova I.A., LopatnikovaJ.A.

Federal State Budgetary Scientific Institution “Research Institute of fundamental and clinical Immunology”, Novosibirsk, Russian Federation

630099, Novosibirsk, Russian Federation, Yadrintsevskaya St. 14 e-mail: sennikov_sv@mail.ru

A protocol of obtaining pure populations of cytotoxic T lymphocytes specific for tumor protein HER2/neu epitopes has been developed. High cytotoxic effect of obtained cells against cell line MCF- 7 has been showed compared to the total fraction of activated mononuclear cells.

Keywords: cytotoxic T lymphocytes, antigen-specific cells, dendritic cells, HER2/neu, stimulation of antitumor immune response

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are considered to be the main agents in realization of antitumor cellular immunity. In modern cancer immunotherapy approaches based on antigen presentation to CTLs by dendritic cells (DCs) are actively applied. The streptamer technology allows isolation of antigen-specific T cells, followed by efficient removal of staining reagents, without affecting cells viability and function. The aim of the study was to obtain antigen-specific CTL populations and evaluate their cytotoxic activity towards tumor line MCF-7. The object of the study are peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy HLAA*02 positive donors. Methods of culturing PBMC, DCs magnetic transfection, flow cytometry, staining and magnetic isolationof HER2-specific T cells by streptamer technology were used.A protocol of obtaining HER2-specific CTLpopulations has been developed. Cytotoxicity analysis of HER2-specific T-cells showed a high level of cytotoxic effect against cell line MCF-7, as compared with that of the total fraction MNC activated (49.3% of damaged tumor cells versus 22.3%).Thus, it was shown that the isolated population of HER2-specific T-lymphocytes is an effector cells population which can effectively eliminate tumor cells.

УДК 57.083.3: 616-002.5

ЭКСПРЕССНАЯ СЕРОДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТОВ НАНОЧАСТИЦ С АНТИГЕНОМ RV0934 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Сотников Д.В., Бызова Н.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.

Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные

основы биотехнологии» РАН, Москва, Россия

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2 e-mail: sotnikov-d-i@mail.ru

Предложены две новые схемы иммунохроматографической серодиагностики туберкулеза

с использованием конъюгата коллоидного золота со специфическим антигеном микобактерии.

Показано преимущество данных схем по сравнению с традиционной схемой, в которой колло- идное золото конъюгировано с антивидовыми антителами или белками A/G.

144 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Ключевые слова: туберкулез, серодиагностика, иммунохроматография, коллоидное золото.

Серодиагностика (выявление в крови обследуемого антител, специфичных к патогену) является эффективным подходом для диагностики инфекционных заболеваний. Иммунохроматографическая реализация серодиагностики представляется наиболее перспективной для массового внелабораторного скрининга.

Поскольку в иммунохроматографии анализ проводится в одну стадию без разделения компонентов, специфические антитела должны детектироваться в присутствии более чем 10-кратного избытка неспецифических. В традиционных схемах иммунохроматографической серодиагностики конкуренция специфических и неспецифических антител за связывание с мечеными антивидовыми антителами или белками A/G ограничивает аналитические возможности тестсистем. Нами предложены две схемы иммунохроматографической серодиагностики, в которых во взаимодействии с меченым реагентом участвуют только специфические антитела. В первой схеме один и тот же антиген сорбируется на поверхность коллоидного маркера и на мембра - ну тест-полоски (окрашенные комплексы в аналитической зоне формируются благодаря наличию у антител нескольких валентностей). Во второй схеме коллоидное золото конъюгируется с антигеном, а в аналитической зоне сорбируется стафилококковый белок А в концентрациях, достаточных для связывания всех иммуноглобулинов в пробе.

В соответствии с предложенными схемами изготовлены опытные образцы иммунохромато- графическихтест-системс использованиемрекомбинантногоантигена38кДа Mycobacterium tuberculosis (Rv0934). Показана их эффективность для серодиагностики легочного туберкулеза, при этом степень выявления серопозитивных сывороток у обследуемых пациентов выше для второй схемы анализа. Продолжительность тестирования составляет 10 минут.

Исследования проведены при поддержке Российского фонда фундаментальных исследова-

ний (грант 13-04-90479_Укр_ф_а).

UDC 57.083.3: 616-002.5

EXPRESS SERODIAGNOSIS OFTUBERCULOSIS BASED ON CONJUGATES

OF NANOPARTICLES WITH RV0934ANTIGEN OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Sotnikov D.V., Byzova N.A., ZherdevA.V., Dzantiev B.B.

A.N. Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology» of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia

119071  Moscow, Leninsky prospect 33, bld. 2 e-mail: sotnikov-d-i@mail.ru

Two new schemes of immunochromatographic serodiagnosis of tuberculosis using conjugate of colloidal gold specific antigen of Mycobacterium are proposed. The advantage of these schemes has been demonstrated in comparison with the conventional scheme which colloidal gold is conju- gated with antispecies antibody or proteins A/G. Keywords: tuberculosis, serodiagnosis, immunochromatography, colloidal gold.

Serodiagnosis (detection of specificanti-pathogen antibodies in the blood) is an effective approach for the diagnosis of infectious diseases. Immunochromatographic realization of serodiagnosis is the most promising decision for mass non-laboratory screenings. Since immunochromatographic assay is performed in one step without components separation, the

specific antibodies should be detected in the presence of more than a 10-fold excess of non-specific

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

ones. For traditional schemes of immunochromatographic serodiagnosis the competition between specific and non-specific antibodies for binding with labelled antispecies antibodies or proteins A/G limits analytical possibilities of test-systems. We propose two schemes of immunochromatographic serodiagnosis,in which specificantibodiesare involvedinto interactionswith labelled reactants.In the first scheme, the same antigen is adsorbed on the surface of the colloidal marker and on membrane of the test-strip (coloured complexes in analytical zone of the strip are formed due to multiple valencies of antibodies). In the second scheme, the colloidal gold is conjugated with an antigen, whereas staphylococcal protein A is adsorbed in the analytical zone in concentrations sufficient to bind all the immunoglobulin in the tested sample.

Prototypes of immunochromatographic test systems were manufactured under the proposed schemes using recombinant antigen 38 kDa of Mycobacterium tuberculosis (Rv0934). Their efficiency for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis has been demonstrated, revealing of seropositive sera is higher for the second scheme. The assay duration is 10 minutes.

The studies were supported by the Russian Foundation for Basic Research (grant 13-04-90479_ Ukr_f_a).

УДК 547.458.38

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КОНЪЮГАТА СИНТЕТИЧЕСКОГО УГЛЕВОДНОГО ФРАГМЕНТА ОПУХОЛЕВОГО АНТИГЕНА-ГАНГЛИОЗИДА GM3 И БЕЛКА ГЕМОЦИАНИНА Степаненко Р.Н.1, Козырева О.В.1, Новикова Е.М.1, ХатунцеваЕ.А.2, Цветков Ю.Е.2, Нифантьев Н.Э.2

1ГНЦ«Институт иммунологии» ФМБАРФ,

115478  Москва, Каширское шоссе, 24/2.E_mail: rstepanenko2009@yandex.ru

2Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Российская Федерация, 119991 Москва, Ленинский просп., 47.

На основе углеводных цепей онкоассоциированного ганглиозид GM3 синтезирован поливалентный углевод-белковый конъюгат— прототип онковакцины, содержащий~400 остатков 3’-(N-ацетил-α-нейраминил)лактозы (сиалил3’-лактозы), присоединенных к одному макромолекулярному комплексу белка гемоцианина. Изучен противоопухолевый эффект неогликоконъюгата на мышах линии C57Bl/6 c перевитой меланомой В16 в сочетании с цитоста- тиком-циклофосфамидом.

Ключевые слова: сиалил3’-лактоза, ганглиозид GM3, гемоцианин, онкоантиген, онковакцина, циклофосфамид, меланома В16.

Благодаря последним достижениям химии углеводов разработаны методы синтеза раз -

личных углеводных опухольассоциированных антигенов, позволяющие получать их в чистом

виде в промышленных масштабах и использовать для конструирования противоопухолевых

кандидатных вакцин. Антигенную специфичность опухолевого антигена -ганглиозида GM3

определяет его углеводный фрагмент 3’-(N-ацетил-α-нейраминил)лактоза, поэтому именно

этот трисахаридный остаток был выбран в качестве иммуногенапри создании противоопу-

холевой вакцины. Для повышения иммуногенности олигосахаридовв составе вакцин широ -

ко применяются их неогликоконъюгаты с высокоиммуногенными белками. В данной работе

мы использовали для этой цели гемоцианин—дыхательный пигмент гемолимфы моллюска

Megathuracrenulata.

146 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “IMMUNOBIOTECHNOLOGY”

Вакцинация синтезированным конъюгатом перед трансплантацией опухолевых клеток и в период роста опухоли на фоне введения циклофосфамида привела к увеличению продолжительности жизни животных и замедлению роста первичного опухолевого узла. В группе мышей получавших сочетанную терапию вакциной и циклофосфамидом к 70 суткам после трансплантации опухолевых клеток в живых осталось 60% животных, в то время как в группе мышей получавших только цитостатик – 13%.

ANTITUMOR EFFECT OFTHE CONJUGATE OF SYNTHETIC CARBOHYDRATE MOIETY OFTHE TUMOR-ASSOCIATED GANGLIOSIDE GM3 WITH HEMOCYANIN

Stepanenko R.N.1, Kozyreva O.V.1, Novikova E.M.,1, Khatuntseva E.A.2, TsvetkovYu.E.2,Nifant´ev N.E.2

1National Research Center “Institute of Immunology”, FMBA of Russia,

24/2, Kashirskoe sh., 115478 Moscow, Russian. E-mail: rstepanenko2009@yandex.ru 2N.D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry, Russian Academy of Sciences,

47  Leninskiiprosp., 119991 Moscow, Russian

Based on the carbohydrate chains of tumor-associated ganglioside GM3, polyvalentcarbohy- drate—protein conjugate was synthesized suitable as a prototype of a cancer vaccinecontaining ~400 3´-(N-acetyl-a-neuraminyl)lactose residues attached to one macromolecular complex of the hemocyanin. The integrated antitumor effect of neoglycoconjugatein combintion with the cytostatic cyclophosphamide was studied on the C57Bl/6 mice with transplanted melanoma B16 cells.

Keywords: 3´-sialyllactose, ganglioside GM3, hemocyanin, cancer vaccine, cyclophosphamide, melanoma B16

The latest achievements of carbohydrate chemistry resulted in the development of methods for the synthesis of various carbohydrate tumor-associated antigens, which can be prepared in a pure state on an industrial scale and are thus suitable for the design of candidate cancer vaccines. The antigen specificity of the ganglioside GM3is determined by its carbohydrate moiety, 3´-(Nacetylneuraminyl) lactose; therefore, this trisaccharide residue was chosen as an immunogen in the development of the cancer vaccine. In order to increase the immonogenicity of oligosaccharides contained in the vaccine, their neoglycoconjugates with highly immunogenic proteins are widely used. In this study, we employed hemocyanin, a respiratory pigment of the Megathuracrenulata keyhole limpet blood plasma, which had been successfully used as the carrier protein in various, including cancer, synthetic vaccines.

Vaccination of mice with syn the sized conjugate before transplantation of melanoma B16/F0 cells and during the tumor growth with simultaneous in troduction of cyclophosphamide results in a more than two foldincrease in the life span of test animals and the suppression of growth of the primary tumor nodule. In the group of mice treated with a cytostatic and vaccinated with the conjugate, 60% of animals survived by the 70th day, whereas in the group treated only with cyclophosphamide, only 13% of animals were alive by the same time.

СЕКЦИЯ | | «ИММУННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ»

ПОСТЕРЫ

POSTERS

УДК 571.27

ОТРАБОТКА СИСТЕМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ Филина А.Б., Власова А.В., Зубачева Д.О., Свитич О.А.

ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5 byzonka@yandex.ru

Получены результаты по оптимальным условиям проведения ПЦР-РВ для изучения экспрессии хемокинов и их рецепторов (СХСL12 и СXCR4), а также изучения полиморфных маркеров в генах интерлейкинов (IL-4 и IL-6).

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция в реальном времени, хемоаттрактанты, интерлейкины, полиморфные маркеры, СХСL12, СXCR4, IL-4, IL-6 .

Введение. Для исследования патогенеза иммунопатологий необходима разработка ПЦР-РВ систем, позволяющих оценить генетику и экспрессию молекул врожденного иммунитета и их рецепторов, а также регуляторных РНК, которые участвуют в иммунологических реакциях. Цель: разработать системы ПЦР-РВ для оценки экспрессионных маркеров в генах CXCL12

иССR4, а также генетических маркеров в генах IL-4 и IL-6. Материалы и методы: Из лейкоцитов периферической крови здоровых доноров выделяли ДНК (К-СОРБ, Синтол, РФ), а из макрофагов – РНК (РИБО-сорб, ИЛС, РФ). Для определения экспрессии использовали наборы «Набор реагентов ОТ-1» и «Набор реагентов для ПЦР-РВ в присутствии красителя SYBR Green I» (Синтол, РФ). Для определения полиморфных маркеров использовали «Набор реагентов для ПЦР-РВ» (Синтол, РФ). ПЦР-РВ проводились на амплификаторе PicoReal (Thermo Scientific). Результаты: В результате проведенной работы были получены следующие данные: оптимальная температура для ПЦР-РВ системы CXCL12 – 62°С, ССR4 – 60°С, концентрация Mg2+ при этом – 75 µМ, IL-4 – 62°С, концентрация Mg2+ – 75 µМ; IL-6 – 54°С и 75µМ Mg2+, соответствен-

но. Заключение: отработанные системы могут применяться для определения экспрессионных

игенетических маркеров, связанных с нарушением цитокиновой сети при патологических состояниях иммунной системы. В перспективе планируется создание систем для детекции регуляторных РНК, которые играют ключевую роль в клетках врожденного иммунитета.